猪流行性腹泻病毒与猪链球菌混合感染的诊断

巢万鹏

(汨罗市畜牧水产服务中心，湖南 汨罗 414400)

0 引言

生猪养殖过程中仔猪腹泻是十分常见的临床疾病，但可导致仔猪腹泻的病因较多，包括病原感染、营养不足甚至是毒素中毒等，其中病原包括有细菌、病毒和寄生虫等[1-2]。猪流行性腹泻病毒(PEDV)是导致仔猪腹泻的常见肠道病毒，该病原感染仔猪可导致较高的发病率与死亡率，其中病畜临床症状主要包括急性水样腹泻、呕吐等，最终因严重脱水而死亡[1]。PEDV属于冠状病毒，该病原在1971年首次于英国被发现，其后在全世界各地猪群均有报道，如欧洲、亚洲和北美洲等地区。2010年以来我国多地区爆发PEDV变异株，且PEDV变异株的出现与流行给我国养猪业造成难以估量的经济损失[3]。

猪链球菌在我国猪场广泛存在，其中部分血清型猪链菌(如血清2型)可感染人，因此该病原为重要的人畜共患性传染病。猪链球菌感染猪群后可导致病畜出现严重的脑膜炎、关节炎和心内膜炎等，若该病原通过病畜感染给养殖人员或消费者，则导致人的急性脑膜炎或感染性中毒等，严重时可导致休克或死亡。因此，猪链球菌的流行严重危害我国养猪业的健康发展，同时对公共健康也造成巨大的威胁[4]。

2020年4月，湖南省汨罗市某规模化猪场部分栏舍出现疫情，主要表现为仔猪严重腹泻、呕吐等，且部分仔猪关节肿大，并出现较高的发病率和死亡率。笔者通过流行病学调查、临床诊断及实验室诊断等，最终判定为PEDV和猪链球菌混合感染，其详细报告如下。

1 猪场发病情况

湖南省汨罗市某规模化猪场饲养繁殖母猪200余头，2020年4月中旬，该场3号产房部分栏舍有仔猪出现腹泻症状，其后饲养员对腹泻仔猪口服抗生素，但腹泻情况没有得到好转，且临近栏舍猪群也开始腹泻和呕吐等，至4月20号左右，该产房已有128头仔猪腹泻，死亡52头。

2 临床及病理症状

笔者进入该场观察发病猪群整体状况，发现该场腹泻仔猪粪便为黄色水状，且肛门括约肌因高频率腹泻处于张开状态，少部分仔猪也出现呕吐症状。此外，也发现有极个别仔猪关节肿大，手触摸肿胀处有波动感，但此类病猪没有出现呼吸困难或神经症状等。

对发病严重、具有临床表现特征的2头病猪进行剖检，可发现该病猪腹股沟和颌下淋巴结肿大并充血，关节处划开可见较为黏稠的浓汁，病猪的肺脏、肝脏和脾脏等未出现明显的病理变化，可见肠壁变薄、肠系膜充血等，且小肠内有黄色黏稠的液体等。

3 实验室诊断

3.1 细菌分离鉴定及药敏试验

无菌采集关节腔内黏稠液体、腹股沟和颌下淋巴结，用高温灼烧的接种环(冷却后)蘸取少量组织液后在TSA鲜血琼脂培养基上进行平板划线，将培养基放置在37℃恒温箱内培养24 h，每隔12 h观察培养基表面是否有菌株及其生长情况。若平板表明有菌株生长，则对单一的菌株进行涂片并染色镜检，观察菌株的形态学特征，此外，采用美国临床实验室标准化协会推荐的药敏纸片法对分离菌株进行药敏试验[5]。结果发现，在仔猪的关节腔和淋巴结中均分离到菌株，其在TSA培养基表面可形成灰白色、湿润透明的菌落，且菌落周围有溶血环，将单一菌落进行革兰氏染色，并油镜观察发现该菌株为革兰氏阳性，且椭圆形的菌体呈短链状的排列，可初步鉴定为猪链球菌。进一步药敏试验结果表明，该菌株对氧氟沙星、头孢噻呋钠和环丙沙星等抗生素敏感，但对其他抗生素(如卡那霉素、头孢拉定、头孢唑林和羧苄西林等)存在不同程度的耐药。

3.2 组织样品核酸提取及病毒检测

将组织样品(主要为淋巴结和小肠)混合后剪碎，取约2.0 g样品与10 mL灭菌PBS溶液混合、研磨，将混合样品高速离心后取上清，用DNA与RNA核酸共提试剂盒提取上清核酸，同时用商业化试剂盒将部分核酸样品中RNA反转录为cDNA，设计并合成可导致仔猪腹泻的常见病原保守性引物，以样品核酸为模板，通过RT-PCR法检测样品中是否存在PEDV、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和德塔冠状病毒(PDcoV)，以及猪伪狂犬病毒(PRV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)和猪圆环二型病毒(PCV2)核酸。结果发现，2头发病仔猪组织样品中均检测出PEDV核酸，但其他检测病原均为阴性。

由于目前我国流行的PEDV毒株包括疫苗株和变异株，为进一步分析该场爆发的PEDV毒株基因型，扩增了该毒株的S基因部分序列，并将该序列进行测序与分析，结果发现该毒株S基因部分序列与Genbnak收录的国内流行的PEDV变异株核苷酸序列高度同源，但与CV777等疫苗株同源性相对较低。

4 诊断结果

结合临床诊断与实验室诊断结果，最终可判定该场出现PEDV与猪链球菌混合感染，且PEDV毒株为变异株。

5 结语

目前，PEDV是导致我国猪场仔猪腹泻的主要肠道病原，导致仔猪腹泻的病原较多，且临床及病理变化较为类似，这需要实验室诊断技术(如PCR法和ELISA法等)对病原进行准确诊断。同时我国流行的PEDV毒株可分为疫苗株和变异株，已有研究表明，现在市场上基于疫苗株研发的疫苗尚不能完全抵抗变异株对仔猪的感染，因此需要通过分子生物学技术确定猪场爆发PEDV毒株的基因型特征，从而具有针对性地选择更加有效的疫苗进行防控。

此外，由于抗生素的不合理使用，导致猪场出现耐药性严重的细菌性病原较为常见，本案例中发生的猪链球菌株也对部分抗生素具有较强的耐药性。对于此类细菌性病原的防控，可采用常规实验室技术对菌株分离后，采用药敏试验分析菌株对哪些抗生素敏感，从而选择有效的药物进行防治。