基于液质联用技术的健脾养正消癥方治疗胃癌小鼠血清代谢组学分析

徐婷婷，熊玥，张婷，严士海，吴坚，刘沈林，刘史佳，张其德

(1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学医学·整合医学学院，江苏 南京 210023；3.江苏省畜产品质量检验测试中心，江苏 南京 210036)

胃癌是全球第五大常见的癌症，其发病率和死亡率居于恶性肿瘤前列[1]。据估计，全球每年有约超100万的新发病例，我国占40%，随着新的治疗手段的不断发现，在全球范围看其发病率和死亡率整体有下降趋势，但我国依旧处于较高水平[2]。目前，胃癌早期的治疗手段主要为内镜下黏膜切除术(EMR)和内镜下黏膜剥离术(ESD)。进展期胃癌多以胃癌根治术为主，辅以靶向治疗、化疗、免疫治疗和支持治疗等[2-3]。以上现代医学治疗手段虽能在一定程度上提高患者存活率，但在治疗过程中患者正气受损，进而影响了患者的生存质量，缩短了其生存期[4]。而中医药因其不良反应小、可减轻化疗不良反应的优势，在胃癌综合治疗、缓解症状、提高生命质量等中发挥了重要的作用，受到了人们越来越多的重视[5]。

中医认为脾虚正衰是晚期胃癌的病机关键，癌毒弥留为晚期胃癌的重要致死因素。全国名中医刘沈林教授临床治疗上强调应以宏观辨证与微观辨病相结合，一则健脾养正，滋养后天；一则化瘀消癥，攻邪除结。晚期胃癌的治疗关键在于扶正健脾以调节气血阴阳，设立经验方健脾养正消癥汤，方中黄芪、党参、炒白术、茯苓、山药、薏苡仁、炙甘草益气健脾，淡渗利湿，补益中焦以恢复其运化受纳之功；气虚之证常兼气滞，谓之“虚气留滞”，用陈皮、木香行气化滞，斡旋气机，以助运化；当归、白芍养血柔肝，和营消瘀；菝葜、石打穿解毒抗癌，消癥化积。诸药合用以补益中气，渗湿泄浊，行气化滞，和营养血，抗癌解毒，以复脾胃受纳与健运之职，共奏健脾益气、解毒消癥之功。临床使用可显著改善胃癌患者的临床症状和检测指标，疗效确切。通过现有的基础试验结果，健脾养正消癥方能够抑制移瘤的生长及提高免疫状态[6]。

代谢组学是考察生物体在受到外界病理生理刺激或扰动后生物体内所有代谢物质变化的科学[7]，是当今科学研究的热点和重点领域，在揭示生物体代谢活动、疾病的发病机制、诊断治疗、药物发现、药效作用机制等方面发挥了越来越重要的作用。综上所述，为研究健脾养正消癥方治疗胃癌的疗效相关特征分子，本实验以裸鼠皮下移植瘤为实验模型，采用UPLC-Q-TOF/MS技术，检测给予健脾养正消癥方前后SGC-7901裸鼠的血清代谢物变化规律，进而探讨健脾养正消癥方在调控胃癌内源性机制方面的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞及动物

人胃癌SGC-7901细胞(由中国科学院上海实验动物中心提供)；SPF级BALB/c-nu裸鼠36只，均为雄性，4周龄，体质量(16.6±0.92)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2012-0001。在12 h光照/黑暗循环下将小鼠圈养在标准温度(20±2)℃和湿度(50%±10%)条件下。在开始实验之前小鼠适应性饲养至少7 d。实验经中国药科大学动物伦理委员会批准。

1.2 试剂和仪器

健脾养正消癥方，低剂量组(方药组成：黄芪30 g，党参15 g，炒白术10 g，茯苓10 g，山药15 g，薏苡仁20 g，陈皮6 g，木香10 g，当归10 g，白芍10 g，菝葜30 g，石见穿30 g，炙甘草3 g)，高剂量组(重用黄芪60 g，党参30 g，余同低剂量组)。经南京中医药大学朱玉凤教授鉴定，由南京中医药大学附属医院提供中药煎剂，10倍蒸馏水加热回流提取2次，每次1 h，合并提取的药液，水浴浓缩，灭菌备用。小牛血清(杭州四季青公司，批号：20150511)；RPMI-1640培养基(南京凯基生物有限公司，批号：150812)；胰蛋白酶(美国Gibco公司)；甲醇、乙腈(美国TEDIA公司，色谱纯)；氯代苯丙氨酸溶液(上海源叶生物科技有限公司)；甲酸(德国Fisher公司，色谱纯)。

CO2培养箱(美国Thermo公司)；倒置显微镜(奥林巴斯公司)；微量移液器(德国Eppendorf公司)；岛津LC-30AD液相色谱仪(日本岛津公司)；AB Sciex Triple TOF 5600质谱检测器(美国AB公司)；Thermo 5430R离心机；Sorvall Legend Micro 17微量离心机；涡旋仪(金坛西城新瑞仪器厂)。

2 方法

2.1 细胞培养

将第6代人胃癌SGC-7901细胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基在37 ℃、5%CO2、完全饱和湿度条件下常规培养，倒置显微镜下观察细胞生长状态，细胞生长呈70%～80%融合状态时以0.25%胰蛋白酶消化传代，每2～3 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

2.2 动物实验

2.2.1 裸鼠皮下移植瘤模型的构建 将处于对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞的细胞浓度调整为1×108mL-1，每只裸鼠右侧腋下接种0.2 mL的细胞悬液，待所有的瘤组织长至大约50～100 mm3时，造模成功，进入实验。

2.2.2 动物分组及给药 将36只裸鼠随机分为模型组(Model)，健脾养正消癥方高(LDMEH)、低剂量组(LDMEL)，每组12只。模型组予以生理盐水灌胃，0.2 mL/次，2次/d，5次/周，连续3周。健脾养正消癥方高、低剂量组分别以健脾养正消癥方74.30、37.15 g/kg灌胃，0.2 mL/次，2次/d，5次/周，连续3周。灌药结束后次日处死荷瘤裸鼠，剖瘤称质量。末次给药24 h后对所有小鼠进行眼球取血，取约0.5～1 mL于血清管中，转速3 500 r/min，离心10 min取上清后转入-80 ℃冰箱中冻存待测。

2.2.3 抗肿瘤效果观察 以荷瘤裸鼠体质量的变化来反映健脾养正消癥方对治疗状态的影响，体质量每5 d测定1次，直至末次给药治疗后。以瘤质量抑制率=(模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量×100%,来评估健脾养正消癥方的抗肿瘤效果。

2.3 样品前处理

取血清样品各45 μL，离心10 s后，加入3倍量乙腈沉淀蛋白，涡旋30 s后，4 ℃静置过夜。于4 ℃以13 000 r/min离心10 min，取上清并挥干，再用100 μL 50%乙腈溶液复溶，4 ℃离心后取90 μL于进样小瓶中待测。同时将各组血清样品合并作为质量控制(Quality control,QC)样品，以相同方法处理。每隔8个样品分析QC样品，以检验仪器的稳定性。

2.4 色谱分析方法

色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)，梯度洗脱采用流动相A(1‰甲酸水)和流动相B(1‰甲酸乙腈)。流速：0.4 mL/min；进样量3 μL；柱温：40 ℃；洗脱梯度程序：0.5 min，3%B；0.5～1.5 min，20%B；1.5～4 min，65%B；4～11 min，95%B；11～15 min，95%B；15～15.4 min，3%B；15.4～20 min，3%B。

2.5 质谱方法

使用AB SCIEX Triple TOF 5600，采用ESI离子源，质谱参数为：MS质量范围m/z60～1 000；源温度550 ℃；雾化气压力50 psi(1 psi=6.8948 Pa)；辅助气压力50 psi；气帘气压力30 psi；离子扫描电压5 500 V(正离子模式)；MS2质量范围m/z40～1 000。

2.6 统计学方法

获取UPLC-Q-TOF/MS图谱后，采用Analyst©TF 1.7导出原始数据，使用Markview软件进行峰对齐。原始数据导入One-MAP代谢云平台获取最终的峰表。将峰表导入MetNormalizer R包中进行QC数据标准化[8]，校正后的数据导入SIMCA-14.1软件(14.1 Version，Umertrica AB, Sweden)进行多维统计分析。通过OPLS-DA的VIP>1和P<0.05为标准来筛选前后变化显著的差异代谢物，采用大连达硕开发的代谢组学小分子化合物快速鉴定分析软件系统OSI/SMMS2.0将代谢物在HMDB(Human Metabolome Databatabase)、METLIN和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库中检索与确认，得到最终匹配内源性代谢物。已鉴定的内源性差异代谢物利用MetaboAnalyst 5.0软件进行相关代谢通路分析。

3 结果

3.1 健脾养正消癥方对SGC-7901细胞裸鼠抗肿瘤效果

结果表1～2。

表1 不同组别裸鼠各阶段体质量比较

表2 各组裸鼠皮下移植瘤瘤质量及抑瘤率比较

3.2 总离子流图(Total ion chromatogram，TIC)

采用UPLC/Q-TOF-MS方法检测获得正负离子TIC图(图1)。从TIC图中可以直观地发现模型组小鼠血清和健脾养正消癥方高、低剂量组小鼠中存在一些差异。经过80%去零规则消除缺失值，一共提取出了539个正离子，258个负离子。同时获取到相应的色谱峰高及峰面积。

注：正离子模式下,A.模型组;B.健脾养正消癥方低剂量组;C.健脾养正消癥方高剂量组；负离子模式下,D.模型组;E.健脾养正消癥方低剂量组;F.健脾养正消癥方高剂量组

3.3 多变量统计分析

采用PCA模型观察模型组、健脾养正消癥方高剂量组和低剂量组之间的总体分布趋势，以及给予健脾养正消癥方后的裸鼠血清代谢物整体变化情况。正离子模式下PCA分析得到一个含3个主成分的模型R2X为0.614，Q2为0.482。负离子模式下PCA分析得到一个含4个主成分的模型R2X为0.417，Q2为0.764，说明本次PCA模型的解释性和预测性都较好。图2可见正负离子模式下3组血清样本在空间上的分布情况，结果显示3组血清样本在正负离子模式下都能够明显区分。健脾养正消癥方低剂量组与模型组产生明显区分，并向高剂量组方向偏移，说明健脾养正消癥方影响了SGC-7901细胞裸鼠血清中的代谢物，对其体内的代谢起到一定的调节作用。

注：A.正离子模式的PCA得分图;B.负离子模式下PCA得分图

采用OPLS-DA分析方法去除与分组无关的信息后，对血清全谱进行模式判别分析，来突出组间差异，寻找潜在的差异代谢物。如图3～4所示，在正负离子模式下，两两对比样本能够显著分离，利用置换检验(Permutation test)对各OPLS-DA模型进行重复性和可靠性检验，结果显示:模型有效，具有较高的稳定性和预测能力。

注：A.健脾养正消癥方低剂量组与模型组对比的OPLS-DA得分图；B.健脾养正消癥方高剂量组与模型组对比的OPLS-DA得分图；C.健脾养正消癥方低剂量组与模型组对比的置换检验图；D.健脾养正消癥方高剂量组与模型组对比的置换检验图

注：A.健脾养正消癥方低剂量组与模型组对比的OPLS-DA得分图；B.健脾养正消癥方高剂量组与模型组对比的OPLS-DA得分图；C.健脾养正消癥方低剂量组与模型组对比的置换检验图；D.健脾养正消癥方高剂量组与模型组对比的置换检验图

3.4 差异代谢物筛选与鉴定

为进一步确定给药后裸鼠血清内源性代谢物的差异，采用OPLS-DA模型中的变量投影重要度(VIP)值，VIP>1和t检验中P<0.05为标准来筛选潜在的差异代谢物。倍数变化(Fold change,FC)来反映健脾养正消癥方高剂量组、低剂量组和模型组相比较血清代谢物峰面积的比值，FC>1表明健脾养正消癥方高剂量组或低剂量组裸鼠血清中该代谢物含量上升，FC<1表明健脾养正消癥方高剂量组或低剂量组裸鼠血清中该代谢物含量下降。采用大连达硕OSI/SMMS2.0数据库以及KEGG、HMDB以及METLIN等网上数据库检索对筛选出的差异代谢物进行鉴定，共鉴定了67种代谢物。LDMELvsModel和LDMEHvsModel符合标准的各有10个内源性差异代谢物，重叠的内源性差异代谢物有5种，包括正离子模式下(ESI+)2个，负离子模式下(ESI-)3个，如表3所示。

表3 低剂量组和模型组比较、高剂量组和模型组比较的差异代谢物

3.5 代谢通路分析

为了寻找健脾养正消癥方治疗胃癌的相关代谢通路，将5个差异代谢物输入MetaboAnalyst 5.0在线网站进行代谢通路分析，依次查看各差异代谢物在KEGG数据库中所对应的作用靶点，如表4所示，代谢通路主要涉及α-亚麻酸和亚油酸代谢、果糖和甘露糖的降解、半乳糖代谢以及花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)代谢。如图5所示，与差异代谢物相关性较强的是由花生四烯酸激活的α-亚麻酸、亚油酸(Linoleic acid，LA)代谢和花生四烯酸代谢通路。

表4 代谢通路分析

注：a.花生四烯酸代谢；b.α-亚麻酸和亚油酸代谢；c.果糖和甘露糖的降解；d.半乳糖代谢

4 讨论

健脾养正消癥方是刘沈林教授针对胃癌本虚标实，即正气不足为本，瘀毒内结为标的基本病机创立的[6]。长期的临床经验证明此方对于胃癌具有良好的治疗效果，联合化疗可以提高化疗抑制胃癌转移的效果，改善患者细胞免疫功能，提高患者治疗期间生活质量，延长患者生存期[9-10]。本研究通过建立人胃癌SGC-7901细胞裸鼠模型，采用UPLC-Q-TOF/MS技术的代谢组学方法探索该方治疗小鼠胃癌前后血清代谢物的变化以及代谢途径，发现治疗前后小鼠的血清代谢物水平显著差异。实验结果显示，与模型组相比，给予健脾养正消癥方低剂量和高剂量组的胃癌小鼠体内花生四烯酸含量逐渐上调，并呈剂量依赖性，进而触发了α-亚麻酸、亚油酸代谢和花生四烯酸代谢通路。

AA是一种人体内含量较多，分布最广的人体非必需多元不饱和脂肪酸，主要以磷脂的形式存在于细胞膜上，并在体内发挥重要的生理病理作用[11]。众所周知的是AA在炎症和病理条件下，会释放为游离AA并通过环氧合酶(Cyclooxygenase，COX)途径生成前列腺素(Prostaglandins，PGs)和血栓素(Thromboxanes，TXs)；脂氧合酶(Lipoxygenases，LOXs)途径生成白三烯(Leukotrienes，LTs)，脂氧素(Lipoxins，LXs)和羟基二十碳四烯酸(Hydroxyeicosatetraenoic acids,HETEs)；通过细胞色素P-450酶途径生成环氧二十碳四烯酸(Epoxyeicosa enoic acids,EETs)等一系列AA代谢产物，进而促进炎症反应等机体的生理活动[12]。

AA在体内主要由亚油酸(LA)转化合成，但在LA缺乏，无法合成人体所需AA。目前，多个国家批准AA作为营养添加剂使用，现市场上多种保健品和婴幼儿奶粉中已添加AA[13]。其次，有研究表明AA在促进骨骼肌组织的修复与生长、保护神经系统健康、改善阿尔兹海默症早期症状减缓疾病进展、增强免疫力等方面发挥着重要作用[14-15]。并且，在正常代谢情况下，AA的增加不会引起炎症反应，不仅如此，还有研究表明AA与促炎症的IL-6和IL-1水平呈负相关，与抗炎肿瘤坏死因子-β水平呈正相关，这说明当AA水平升高时可产生抗炎和抗肿瘤效果[16]。同时，AA代谢产物前列腺素(Prostaglandins,PGs)可以促进免疫细胞吞噬作用，前列腺素E(Prostaglandin E,PGEs)类物质通过对白细胞具有轻度吸引作用，促进白细胞游走，加强中性粒细胞和单核细胞的趋化反应来增强机体的免疫机制[17-18]。研究显示AA通过体内三大代谢途径，产生的前列环素(Prostacyclin,PGI)合成酶、PGI2和PGI受体IP，LXs和LXR，脂肪特异性磷脂酶A2(Adipose-specific PLA2,AdPLA)以及几种分泌型磷脂酶A2(Secreted phospholipase A2,sPLA2s)亚型都表现出抗肿瘤活性，而前列腺素D2(Prostaglandin D2,PGD2)通过激活2种不同的受体发挥其功能，也表现出抗肿瘤特性[19]。

综上所述，AA在损伤相关的炎症和许多疾病状态中发挥着核心作用，它在体内的代谢方式决定了它的促炎或抗炎活性。我们研究发现，给予健脾养正消癥方小鼠的血清中，AA的水平发生显著提高，但并未发现其相关代谢产物的水平发生显著变化。因此健脾养正消癥方可能通过提高AA的体内水平，促进了免疫细胞的吞噬作用，增强了机体免疫力，又或者通过上述AA代谢过程中产生的具有抗肿瘤活性的代谢产物，来抑制肿瘤的生长，涉及的具体机制还需等待进一步的研究探索。