牡荆苷通过促进黏着斑激酶活化抑制心肌缺血/再灌注诱导的心肌细胞损伤

赵越，黄磊，苏枫*，龚群林

（1同济大学附属杨浦医院心内科，上海 200000；2沈阳医学院附属第二医院心内科，沈阳 110002）

急性心肌梗死是严重危害人类健康的全球性公共卫生问题之一[1]。冠状动脉闭塞可导致心肌梗死，尽早恢复血流灌流是挽救心肌梗死的优良策略，但缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）可加重心肌损伤，有时甚至会对心脏造成永久性损伤[2]。因此研究改善心肌I/R损伤的干预措施具有重要意义。

牡荆苷（vitexin，Vitx）属于一种天然黄酮类化合物，在我国广泛存在于蔷薇科、马鞭草科和禾本科等几十种中草药中。现代药理研究现已证实其具有如抗炎、抗氧化和抗肿瘤等广泛的药理作用[3-4]。在心血管方面的研究显示，Vitx具有缓解心肌I/R损伤和改善心功能的作用[5-6]。黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）通路是细胞内多条信号传导的交汇点，近来大量研究显示，FAK活化能改善心肌I/R损伤[7-8]。Vitx是否可通过调控该通路发挥抗心肌I/R损伤尚鲜有相关报道。因此，本研究构建缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤H9C2大鼠心肌细胞模型和心肌I/R损伤大鼠模型，探讨Vitx是否可通过调控FAK活化对心肌细胞发挥保护作用，为Vitx应用于心肌梗死的治疗提供新证据。

材料与方法

1 细胞、实验动物与主要试剂

H9C2大鼠心肌细胞和Annexin V-FITC/ PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒购自武汉普诺赛生命科技有限公司；7～8周龄雄性SD大鼠（SPF级，290～310 g）购自河南省实验动物中心[SCXK（豫）2017－0001]；牡荆苷（Vitx，纯度＞98%）购自成都乐美天医药科技有限公司；FAK抑制剂Y15和CCK-8细胞活力检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；Cleaved Caspase 3、FAK和p-FAK小鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；GAPDH抗体和HRP标记的羊抗小鼠二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2 细胞培养、Vitx浓度筛选与H/R模型构建

将H9C2大鼠心肌细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，取生长期细胞用于后续实验。用不同浓度梯度（0～800 μmol/L）的Vitx刺激H9C2细胞24 h，用CCK-8实验测定细胞活力，筛选无细胞毒性的剂量范围的Vitx用于后续实验。37 ℃条件下采用94% N2、5% CO2和1% O2的混合气培养H9C2细胞4 h，之后，再置于常氧中培养2 h，建立H/R心肌细胞损伤模型。

3 细胞分组

为检测Vitx对H/R诱导的心肌细胞损伤的影响，将H9C2细胞分为对照组（常氧培养）、H/R组和不同剂量Vitx治疗组；其中不同剂量Vitx治疗组H9C2细胞先分别采用5 μmol/L、10 μmol/L和50 μmol/L Vitx预处理1 h，然后再构建H/R模型。为验证Vitx通过调控FAK活性参与对H/R下的心肌细胞保护作用，将H9C2细胞分为对照组（常氧培养）、H/R组、H/R+Y15组（1 μmol/L Y15预处理1 h，再构建H/R模型）和H/R+Y15+ Vitx（50 μmol/L）组。

4 CCK-8实验检测细胞活力

将H9C2细胞种植到96孔板中，按照各组分组方法处理后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，并在37 ℃条件下孵育1.5 h，用酶标仪测量450 nm波长处的光密度值。细胞活力=处理组光密度值/对照组光密度值×100%。

5 流式细胞术检测细胞凋亡

用无EDTA的0.2%胰酶消化各组细胞，用以3600 r/min离心5 min收集细胞。用PBS重悬细胞2次，然后加入400 μL结合缓冲液并混匀，在暗室加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温孵育15 min，用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

6 心肌I/R损伤模型的建立和分组处理

SD大鼠经规范喂养1周后，进行心肌I/R损伤造模：将禁食12 h的大鼠通过腹腔注射7%水合氯醛（0.5 mL/100g）麻醉后，仰卧放置在操作台上，进行左开胸手术，用7-0丝线活结结扎左心耳下的冠状动脉左前降支，缺血1 h后，解开活结，实现血液再灌注。30只SD大鼠随机分为假手术组、I/R组和不同剂量Vitx治疗组。假手术组大鼠的手术程序同I/R造模手术，但不进行冠状动脉左前降支结扎；不同剂量Vitx治疗组大鼠在I/R造模1 h前，分别通过尾静脉注射10 μmol/L、50 μmol/L和100 mg/kg Vitx。I/R术后1 d，麻醉大鼠，仰卧固定，开胸，从心尖处进针至左心室并灌注生理盐水，同时在右心耳开口，灌注至肝脏变白以及血水变为无色时切取心脏。

7 免疫组织化学染色

用0.9%盐水冲洗心脏表面，用眼科剪将心房及主动脉等相连组织剪去，然后剪去右心室，收集左心室组织。将左心室组织沿长轴剪成俩部分，取一部分左心室组织沉浸在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，然后用Leica VT1200S全自动振动切片机（德国徕卡公司）连续切为2 mm厚的切片。收集切片，然后依次经70%乙醇1 h、80%乙醇1 h、90%乙醇1 h、95%乙醇30 min、无水乙醇15 min、醇苯5 min和二甲苯15 min后行石蜡包埋。将石蜡包埋的左心室心肌组织用Leica 石蜡切片机切成5 μm厚的切片，然后依次经60 ℃烤片45 min、二甲苯（15 min×2次）、无水乙醇（10 min×2次）、95%乙醇10 min、90%乙醇10 min、80%乙醇10 min、70%乙醇10 min和自来水浸泡10 min，加入3% H2O2浸泡10 min除去内源性过氧化氢酶，然后用柠檬酸缓冲液煮沸进行抗原修复。用10%BSA封闭30 min后，用小鼠抗Cleaved-Caspase 3单克隆抗体（1:100）4 ℃孵育过夜；PBS洗片后，滴加生物素标记的抗小鼠二抗（1:100），室温孵育1 h；PBS洗片后，滴加SABC（1:100）室温孵育45 min；PBS洗片后，DAB显色5 min；清水冲洗后，苏木素复染5 min；脱水、透明后，中性树脂封片，光学显微镜观察左心室心肌组织中Cleaved Caspase 3免疫反应性。

8 TUNEL染色

将左心室心肌片脱蜡水化后，用不含DNase的蛋白酶K作用30 min，PBS洗片，加入3% H2O2浸泡10 min除去内源性的过氧化氢酶；PBS洗片后，加入生物素标记的TUNEL反应液并室温孵育1 h；PBS洗片后，加入终止液室温孵育10 min；PBS再次洗片后，加入HRP标记的链酶亲和素并室温孵育1 h；PBS洗片后，DAB显色5 min，苏木素复染5 min；脱水、透明后，中性树脂封片，光学显微镜观察左心室心肌组织中TUNEL阳性细胞。

9 Western blot

用RIPA提取培养的细胞以及新鲜的左心室心肌组织中的蛋白，蛋白经定量后，进行Western blot电泳和电转。用10%BSA封闭PVDF膜上蛋白30 min，然后用小鼠抗FAK（1:3000）、p-FAK（1:1000）和GAPDH抗体（1:10000）4 ℃孵育过夜；TBS-T洗膜后，滴加HRP标记的抗小鼠二抗（1:2000），室温孵育1 h；TBS-T洗膜后，在均匀涂洒SH Super-Sig™超敏ECL化学发光试剂（杭州申花科技有限公司）后用SH-Focus 523化学发光成像系统（杭州申花科技有限公司）电化学发光显像。用Image J软件量化蛋白的光密度值，GAPDH用作内部参照（评估上样总量差异），然后以计算p-FAK相对FAK的表达水平，p-FAK的相对表达水平=（p-FAK光密度值/GAPDH光密度值）/（FAK光密度值/GAPDH光密度值）。

10 统计学分析

实验数据用均数±标准差表示，并使用Graph-Pad Prism7.0软件采用单因素方差分析法对数据进行统计分析，采用SNK-q法对多组的均数进行两两比较。P＜0.05定义为差异有统计学意义。

结 果

1 Vitx剂量依赖性抑制H/R诱导的H9C2细胞损伤与FAK活性降低

首先，用CCK-8法筛选Vitx的剂量范围，可见Vitx在1～100 μmol/L剂量范围内对H9C2细胞无细胞毒性，后续实验选择5～50 μmol/L剂量范围（图1A）。用CCK-8法观察Vitx对H/R诱导的H9C2细胞活力的影响，结果显示，H/R能导致H9C2细胞的细胞活力降低，而10 μmol/L和50 μmol/L Vitx治疗能抑制H/R诱导的H9C2细胞的细胞活力降低（图1B）。流式细胞术结果显示，H/R能导致H9C2细胞凋亡，而（5～50）μmol/L Vitx治疗能抑制H/R诱导的H9C2细胞凋亡（图1C和1D）。Western blot检测（图1E和1F）显示，H/R能导致H9C2细胞中p-FAK的表达降低，而10 μmol/L和50 μmol/L Vitx治疗能抑制H/R诱导的H9C2细胞中p-FAK的表达降低。

2 Vitx缓解FAK抑制剂对H/R诱导的H9C2细胞损伤的加重作用

为明确Vitx是否通过促进FAK活化来抑制H/R诱导的心肌细胞损伤，进一步观察了Vitx对FAK抑制剂Y15预处理H9C2细胞的H/R模型的影响。流式细胞术分析显示：Y15预处理显著增加 H/R诱导的 H9C2细胞凋亡增加和细胞活力降低，Vitx处理则显著抑制Y15预处理对H/R诱导的H9C2细胞凋亡和细胞活力降低的增强作用（图2A-C）；Western blot检测显示：Y15预处理显著增加 H/R诱导的 H9C2细胞p-FAK表达降低，Vitx处理可逆转Y15预处理对H/R诱导的H9C2细胞p-FAK表达的降低（图2D、F）。

图2 Vitx抑制Y15对H/R诱导的H9C2细胞损伤和p-FAK表达降低的增强作用。A和B，流式细胞术检测Vitx和Y15对H/R模型细胞凋亡的影响；C，CCK-8法检测Vitx和Y15对H/R模型细胞活力的影响；D和E：Western blot检测Vitx和Y15对H/R模型细胞中p-FAK表达的影响；与对照组比较，***P＜0.001；与H/R组比较，#P＜0.05；与H/R+Y15组比较，&P＜0.05；n=3。Fig. 2 Vitx inhibited the aggravation effect of Y15 on H/R-induced injury and p-FAK expression decrease of H9C2 cell. A and B， flow cytometry detection for the effect of Vitx and Y15 on apoptosis in H/R model cell; C， CCK-8 assay for the effect of Vitx and Y15 on cell viability in H/R model cell; D and E， Western blot detection for the effect of Vitx and Y15 on p-FAK expression in H/R model; ***P＜0.001 vs. Control (Ctrl) group; #P＜0.05 vs. H/R alone group; &P＜0.05 vs. H/R + Y15 group; n=3.

3 Vitx抑制I/R诱导的大鼠心肌组织损伤和FAK活性下调

利用心肌I/R损伤模型进一步分析Vitx对心肌组织损伤和FAK活性的影响表明：I/R显著增加大鼠左心室心肌细胞的TUNEL阳性细胞比例和Cleaved Caspase 3阳性细胞比例，降低p-FAK表达；而50 mg/kg和100 mg/kg Vitx治疗能显著抑制I/R诱导的大鼠心肌组织的细胞凋亡增加和p-FAK表达下调（图3）。

图 1 Vitx抑制H/R诱导的H9C2细胞损伤和p-FAK表达降低。A，CCK-8法筛选Vitx的剂量范围；B，CCK-8法检测Vitx对H/R模型细胞活力的影响；C和D，Vitx对H/R模型细胞凋亡影响的代表性流式细胞术检测和统计学分析；E和F，Vitx对H/R模型p-FAK表达影响的代表性Western blot检测和统计学分析。与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与H/R组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；n=3Fig. 1 Vitx inhibited the H/R-induced myocardial cell injury and the decrease of p-FAK expression. A， the dose range of Vitx was screened by CCK-8 assay; B， CCK-8 assay for the effect of Vitx on cell viability in H/R model; C and D， representative flow cytometry detection and statistical analysis for the effect of Vitx on apoptosis of H/R model cell; E and F， representative Western blot detection and statistical analysis for effect of Vitx on p-FAK expression of H/R model cell; *P＜0.05， **P＜0.01，***P＜0.001 vs. Control (Ctrl) group; #P＜0.05， ##P＜0.01， ###P＜0.001 vs. H/R alone group; n=3

图 3 Vitx能抑制I/R诱导的大鼠心肌组织细胞凋亡和p-FAK表达降低。A，代表性TUNEL染色和Cleaved Caspase 3免疫组织化学染色图（比例尺，20μm）；B，TUNEL阳性细胞比例的统计结果；C，Cleaved Caspase 3阳性细胞比例的统计结果；D，p-FAK水平的代表性Western blot检测与统计学分析；与假手术组比较，***P＜0.001；与I/R组比较，##P＜0.01，###P＜0.001；n=6。Fig. 3 Vitx inhibited I/R-induced myocardial cell injury and the decrease of p-FAK expression in the rats. A， representative TUNEL staining and Cleaved Caspase-3 immunohistochemical staining images (scale bar， 20 μm); B， statistical analysis of the proportion of TUNEL positive cells; C， statistical analysis of the proportion of Cleaved Caspase-3 positive cells; D， representative Western blotting and statistical analysis of p-FAK level; ***P＜0.001 vs. Sham group; ##P＜0.01， ###P＜0.001 vs. I/R alone group; n=6

讨 论

目前已有如溶栓治疗、血管支架和冠状动脉搭桥术等多种干预措施用于心肌梗死患者的治疗[9]。而这些干预措施对心肌恢复灌流再次造成的心肌二次损伤并没有作用效果。因此，需要对心肌I/R损伤的治疗措施进行进一步研究。目前，中药治疗心肌I/R损伤是一个热门的研究领域，且众多研究表明，中药在治疗心肌I/R损伤中发挥了重要的有益作用[10-11]。Vitx是从蔷薇科、马鞭草科和禾本科等中药材中提取的一种具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤的天然黄酮类化合物[3-4]，且在我国原材料资源丰富，具有极高的研究价值。虽有研究[5-6]表明，Vitx能改善心肌I/R损伤，但为推进其加快应用于临床，仍需对其机制进一步研究。

心肌细胞损伤是心肌I/R损伤病理过程的一个最重要参与者[12]，并且其还是导致心肌重塑、心率不齐、心力衰竭和心功能减退的重要原因[13]。因此，研究抑制心肌I/R导致的心肌细胞损伤的策略具有重要意义。本研究显示，Vitx在细胞模型和动物模型中均能抑制I/R导致的心肌细胞损伤，说明其在心肌梗死中具有保护心肌细胞的作用。FAK是一种非受体酪氨酸激酶，其活化后可促使黏着斑（focal adhesion，FA）上的靶蛋白磷酸化，进而通过激活下游的细胞信号传导途径参与调节细胞迁移、增殖、凋亡和免疫等一系列过程生理过程[14]。之前研究指出，增强心脏FAK活性可通过激活下游效应信号传导来减轻I/R诱导的心肌细胞凋亡[7-8，15]。本研究结果显示，在细胞模型和动物模型中，Vitx抑制I/R导致的心肌细胞损伤的过程中伴随着促进FAK的活化，这些结果提示，Vitx抑制I/R导致的心肌细胞损伤的作用可能与其增强FAK活化相关。为证明Vitx能通过增强FAK活化在心肌I/R中发挥对心肌细胞的保护作用，本研究进一步采用FAK抑制剂Y15预处理H9C2细胞，再给予H/R处理，并观察Vitx的作用，研究结果显示，Vitx能逆转Y15对H/R诱导的心肌细胞损伤的加重作用，这一结果证明了Vitx确实能通过促进FAK活化减轻I/R诱导的心肌细胞损伤。

综上所述，Vitx可以保护心肌细胞免受心肌I/R损伤，且这一作用可以通过促进FAK活化实现。本研究还为Vitx将来应用于心肌梗死的治疗提供了新的理论依据。