沉默COPB2通过调节AKT信号通路抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

郑蕊，邢小飞，靳飞，陈海丽

（郑州市第七人民医院检验科 郑州 450000）

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，也是导致癌症死亡的主要原因[1]。迄今为止，手术，放射化学疗法和个性化靶向疗法仍然是此类癌症的主要治疗方法，但是其治疗效果往往不尽理想[2]。因此，仍需更好地理解肺癌的发生机制并确定新的治疗靶标。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮细胞获得与肿瘤转移有关的间质表型的关键过程[3]。促进EMT的主要信号途径是通过AKT信号通路[4]。许多研究都集中在调节EMT的复杂调控网络上，以解释和发现与癌症进展和转移有关的新机制。

外被体蛋白复合物亚基β2（coatomer protein complex subunit β2，COPB2）是高尔基体的复合物亚基，对于高尔基水泡运输至关重要[5]。最近的研究表明，COPB2在几种类型的癌症中上调，而敲除COPB2可能是人类癌症的治疗靶点[6]。但是，COPB2在非小细胞肺癌中的功能作用仍然未知。本研究试图通过沉默COPB2观察其抑制非小细胞肺癌进展的作用和生物学机制，为非小细胞肺癌治疗提供潜在临床靶标。

材料和方法

1 临床样本收集

收集本院2018年12月—2019年12月的非小细胞肺癌患者的手术后切除的肿瘤组织和癌旁组织，纳入标准为经病理诊断的非小细胞肺癌并首次接受手术治疗的患者，排除标准为患者经放疗、化疗或非首次手术。所有患者均对本试验研究知情，并签署了知情同意书。

2 细胞培养和转染

从美国典型培养物保藏中心购买人肺癌细胞系A549细胞和正常肺泡上皮细胞系BEAS-2B细胞，将其培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，细胞培养箱保持在湿润的37 °C和5%CO2的氛围中。

COPB2-shRNA（COPB2-shRNA1和COPB2 -shRNA2，货号PPLAV05266-1和PPLAV05266-2）购自PPL。为了建立稳定的COPB2敲低细胞，用COPB2 shRNA转染A549细胞，并用含有1.5 mg/ml 嘌呤霉素的细胞培养基中选择1周，然后将细胞在培养基中培养。shRNA处理48 h后，通过蛋白质印迹分析和细胞免疫荧光实验确定蛋白的敲低效率。

3 免疫印迹

用NETN缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mol/L NaCl，1 mol/L EDTA和0.5%Nonidet P-40）制备细胞裂解液，通过SDS-PAGE分离并转移至PVDF膜上。然后将裂解物与兔抗COPB2（1:1000，Bethyl Laboratories，Montgomery，TX，USA）、兔抗p-AKT、AKT、cleaved caspase-3、cyclin D1、Bcl-2和Bax（1:1000，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz）、GAPDH（1:5000，Cell Signaling Technology）的一抗孵育，在4℃过夜。然后将辣根过氧化物酶（HRP）标记的第二抗体与样品在室温下孵育2 h，使用化学发光成像系统（Leica M205 FCA，Leica，Wetzlar，Germany）观察并定量蛋白表达水平。

4 免疫荧光染色

用4%多聚甲醛溶液固定细胞，0.2%Triton X-100渗透5 min，5%牛血清白蛋白封闭后，将样品与抗COPB2抗体（1:200）在4 ℃孵育过夜，洗涤细胞，然后与TRITC-缀合的二级抗体(中山金桥生物技术有限公司，中国北京)在黑暗中孵育1.5 h。在用DAPI (Beyotime生物技术研究所)核染色之后，用抗淬灭固定试剂（Beyotime生物技术研究所）在显微镜载玻片上覆盖载玻片。使用荧光显微镜（Nikon Eclipse Ci-S）进行观察。

5 细胞迁移和侵袭实验

将200 μL无血清RPMI-1640培养基中的4.0×104个细胞加入到Transwell的上腔室中进行迁移实验，或将200 μL无血清RPMI-1640培养基中的10.0×104个细胞添加到带有Matrigel涂层膜的Transwell板的上腔中进行侵袭实验；将包含10%FBS的培养基添加到底部腔室中，温育24 h后，将迁移和侵袭的细胞固定并用结晶紫染色，对染色的细胞照相并计数。

6 MTT法细胞活力测定

将细胞以15，000个细胞/孔铺在96孔板中，并附着过夜，然后添加10 μL MTT试剂（Trevigen），用酶标仪（Bio-Rad iMark；Bio-Rad Laboratories）读取570 nm处的吸光度。

7 EDU法检测细胞增殖

根据制造商的说明书，使用EdU细胞增殖测定试剂盒（Life Technologies，Grand Island，NY）测量细胞增殖。将细胞以15，000个细胞/孔的浓度接种于96孔板中，24～48 h后用磷酸盐缓冲液洗涤一次，然后将板倒置并轻轻敲打在Kimwipe（Kimberly-Clark Professional，Roswell，GA）上干燥，并在-80°C冷冻至少24 h。然后将板解冻至室温，并在细胞裂解缓冲液中用1×EdU染料（与核酸结合时显示增强的荧光）避光染色5 min，继而在480 nm激发/ 520 nm发射下测量荧光。

8 统计学分析

采用SPSS24.0进行统计学分析，数据表示为平均值±标准差，组间比较采用单因素方差分析法。每个实验至少独立执行3次。P值＜0.05则认为差异具有统计学意义。

结 果

1 COPB2在非小细胞肺癌组织和细胞中高表达

蛋白印迹分析显示，与正常肺组织或细胞相比，非小细胞肺癌组织和细胞中COPB2的表达水平显著上升（图1）。

图1 COPB2在非小细胞肺癌组织和细胞中表达的蛋白印迹分析。A，COPB2在非小细胞肺癌组织和癌旁组织中表达水平的代表性蛋白印迹分析结果与统计学分析。B，COPB2在正常肺泡上皮细胞和肺癌细胞中表达水平的代表性蛋白印迹分析结果与统计学分析。与癌旁组织（A）或BEAS-2B细胞（B）相比：***P＜0.001；n=8Fig. 1 Western blot analysis of COPB2 expression in non-small cell lung cancer tissues and cells. A， representative Western blot analysis and statistical analysis of the expression level of COPB2 in non-small cell lung cancer and adjacent tissues. B， representative Western blot analysis and statistical analysis of the expression level of COPB2 in normal alveolar epithelial cells and lung cancer cells. ***P＜0.001， compared with adjacent tissues (A) or BEAS-2B cells (B); n=8

2 沉默COPB2抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭

免疫荧光染色和蛋白印迹分析证明两种COPB2 shRNA均能有效沉默A549细胞中COPB2的表达（图2）。MTT法分析和EDU染色显示，沉默COPB2表达的A549细胞的增殖能力被显著抑制（图3A、B）。Transwell实验检测表明，沉默COPB2可以显著抑制A549细胞迁移（图3C）和侵袭（图3D）。

图2 COPB2 shRNA在A549细胞中沉默效率检测。A，COPB2表达水平的代表性免疫荧光染色检测结果；比例尺，200 μm。B，COPB2表达水平的代表性蛋白印迹法检测结果与统计学分析；与NC-shRNA组相比，**P＜0.01（n=8）Fig. 2 Detection of silencing efficiency of COPB2 shRNA in A549 cells. A， representative immunofluorescence staining results of COPB2 expression level; scale bar， 200 μm. B， representative Western blot detection results and statistical analysis of COPB2 expression level; **P＜0.01， compared with NC-shRNA group (n=8)

图3 沉默COPB2对A549细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。A，MTT法检测细胞活力。B，EDU染色法检测细胞增殖水平；B1，代表性EDU染色检测结果；比例尺，200μm；B2，EDU阳性率统计学分析。C，Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力；C1，细胞迁移和侵袭力的代表性Transwell检测结果；C2，细胞迁移和侵袭力统计学分析。与NC-shRNA组相比：**P＜0.01；n=8Fig. 3 The effect of silencing COPB2 on the proliferation， migration， and invasion of A549 cells. A， MTT assay for cell viability. B， EDU staining to detect the level of cell proliferation; B1， representative EDU staining results; scale bar=200 μm; B2， statistical analysis of EDU positive rate. C， Transwell assay for cell migration and invasion ability; C1， representative Transwell assay results of cell migration and invasion ability; C2， statistical analysis of cell migration and invasion ability. **P＜0.01， compared with NC-shRNA group; n=8

3 沉默COPB2降低p-AKT/AKT比值及上调凋亡蛋白表达

为了探讨沉默COPB2抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭的机制，进一步对AKT信号通路蛋白、细胞周期调控蛋白和凋亡相关蛋白表达水平进行了检测。蛋白质印迹实验显示，沉默COPB2后，A549细胞中p-AKT/AKT比值、cyclin D1和Bcl-2的蛋白表达水平显著下降，Cleaved caspase-3和Bax的蛋白表达水平显著上升（图4）。

图4 沉默COPB2对AKT信号通路蛋白、细胞周期调控蛋白和凋亡相关蛋白表达表达的影响。A，p-AKT、AKT、Cleaved Caspase-3、cyclin D1、Bcl-2和Bax水平的代表性蛋白质印迹检测。B，p-AKT/AKT比值的统计学分析。C， Cleaved caspase-3水平的统计学分析。D，cyclin D1水平的统计学分析。E，Bcl-2水平的的统计学分析。F，Bax水平的的统计学分析。与NC-shRNA组相比：***P＜0.001; n=8Fig. 4 Effects of silencing COPB2 on the expression of Akt signaling pathway proteins， cell cycle regulatory proteins and apoptosis-related proteins. A， Western blotting to detect the protein expression levels of p-AKT， AKT， Cleaved Caspase-3， cyclin D1， Bcl-2 and Bax. B， statistical analysis of p-Akt/Akt ratio. C， statistical analysis of Cleaved Caspase-3 level. D， statistical analysis of cyclin D1 level. E， statistical analysis of Bcl-2 level. F， statistical analysis of Bax level. ***P＜0.001， compared with the NC-shRNA group; n=8

讨 论

非小细胞肺癌是全球最主要的医疗负担之一[7]。非小细胞肺癌可能是高度浸润性的，即使原发灶很小，也可能发生转移，这意味着许多患者出现局部晚期或转移性疾病，导致存活率极低[8]。本研究的目的是研究沉默COPB2表达在人非小细胞肺癌细胞系中的作用。研究结果表明，COPB2是一个致癌基因，可在体外调节A549细胞的细胞增殖、迁移和侵袭。另外，沉默COPB2通过抑制AKT信号通路的活化来发挥其抑癌作用。这些发现确定了人非小细胞肺癌细胞中的COPB2/AKT轴在肿瘤发生发展中的作用，后续的使用需要进一步的研究以确定COPB2/AKT轴在非小细胞肺癌中是否具有潜在的诊断或治疗作用。

COPB2作为一种促癌基因，在几种癌症中细胞中均下调[9]。然而，在不同类型的癌症中，COPB2的表达模式和功能似乎有所不同。在本研究中，COPB2在A549细胞中过表达，而沉默COPB2导致细胞增殖、细胞侵袭和细胞迁移水平均降低。这些发现与以往的研究一致：COPB2的抑制可抑制细胞周期途径，诱导结肠癌细胞中的G0 /G1和S期细胞周期停滞[9]。以往在肺腺癌中的研究表明，COPB2通过调节YAP1表达调节细胞凋亡并促进细胞增殖[10]。这些发现支持COPB2可能在某些类型的人类恶性肿瘤的进展中起作用。此外，cyclin D1是CDK4或CDK6的调节亚基，在细胞周期G1/S过渡中起重要作用。Bcl-2是一种细胞凋亡抑制剂，具有预防细胞凋亡的功能[11]。Bax是一种细胞凋亡调节剂，通过与Bcl-2形成异二聚体来拮抗Bcl-2的功能[12]。本研究发现，沉默COPB2后，A549细胞中p-AKT/AKT比值、cyclin D1和Bcl-2的蛋白表达水平显著下降，而Cleaved Caspase-3和Bax水平显著上升，由此证实，沉默COPB2通过调节AKT信号通路抑制非小细胞肺癌的进展。但是，目前在A549细胞中进行的体外研究的结果需要在其他肺癌细胞系中进行证实，并需要进行功能性体内研究。