3种西兰花种植方式对根际土壤细菌群落结构和多样性的影响研究

陈海生 刘守平 梁国钱 何道根

(1 浙江同济科技职业学院，浙江 杭州 311231；2 台州市农业科学研究院，浙江 临海 317000)

农作物连作可能会导致其根际土壤微生物群落结构失衡，表现出病害加重、产量和品质下降等现象[1-2]。农作物进行合理轮作能够促进耕作层土壤有效肥力的提高和平衡，在控制和防治农作物土传病害方面也发挥着重要作用[3-6]，其中，水旱轮作是目前最有效、最理想的轮作方式[7]。徐幼平等[8]研究表明，水旱轮作可使耕作层土壤微生物群落数量增加、种类改变。陈丹梅等[9]选择云南省具有代表性的几种轮作模式，通过16S rDNA序列分析，研究了水旱轮作和旱旱轮作条件下土壤微生物活性和细菌群落结构的变化，结果认为，在经过连续16年的种植后，各种植模式的土壤微生物生物量碳氮、细菌群落结构和多样性均以烤烟(Nicotianatabacum)-苕子(Viciaspp)-水稻(Oryzasativa)这一水旱轮作模式为最佳，该轮作模式可改善土壤生态环境，促进土壤微生物繁殖，使微生物数量增加、活性增强。此外，大量研究表明，轮作能提高作物根际土壤微生物多样性指数，改善作物根际土壤微生态环境[10-12]。

西兰花(Brassicaoleraceavar.italica)为十字花科芸薹属蔬菜，其原产地为欧洲。西兰花色泽深绿，因其口味独特、营养全面，深受消费者喜爱[13]。台州市光照充足，水热条件丰富，适宜西兰花的生长。目前，台州市西兰花种植面积常年稳定在10 000 hm2左右, 年产量约230 000 t，占全国西兰花总产量的25%，是台州市重要的创汇及内销蔬菜之一[14]。但长期连作产生了连作障碍，导致西兰花产量低、品质差[15]。台州市属于浙江省经济发达地区之一，西兰花的高度集约化和大量化肥投入使土壤团粒结构破坏，造成土壤退化现象。有研究表明西兰花套作糯玉米(ZeamaysL.sinensisKulesh)能提高土壤微生物生物量碳和生物量氮含量，以及土壤脲酶、中性磷酸酶和蔗糖酶活性，有效缓解西兰花连作障碍[16]。另有研究表明，“西兰花-早稻”水旱轮作能明显提高西兰花种植地土壤细菌、真菌和放线菌数量以及土壤微生物生物量碳和生物量氮含量，有效改善西兰花种植地土壤微生物环境，并显著提高土壤脲酶和蔗糖酶活性[17]。但采用高通量测序技术分析西兰花不同轮作方式对西兰花根际土壤细菌群落结构和多样性的影响研究尚鲜见报道。

在台州湾滩涂围垦地西兰花种植区选择当地最主要的水旱轮作和旱旱轮作方式——西兰花-早稻轮作和西兰花-南瓜(Semencucurbitae)轮作，并以西兰花连作为对照，采用高通量测序方法[18-20]，研究3种种植方式对西兰花根际土壤细菌群落结构和多样性的影响，以期为提出该区域西兰花合理耕作措施、实现台州湾西兰花可持续发展提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验地概况

试验所用西兰花品种为台绿3号，由台州市农业科学研究院提供；南瓜品种为蜜本南瓜-棱王968，由广东金记种业科技有限公司提供。

试验点位于浙江省临海市上盘镇磊石坑村西兰花种植基地(28°34′N，121°30′E)，属中亚热带季风湿润气候，年日照时数1 785.7～3 118.6 h，年太阳辐射总量为5 040～5 400 MJ·m-2，年平均气温17.0℃，极端最高气温37.5℃，极端最低气温-6.8℃，≥10℃的年积温5 332.7℃，无霜期257 d，年降雨量1 300～1 400 mm，40%集中在春雨和梅雨季节，台风暴雨频率高，强度大，常易遭受洪涝灾害。研究区属台州湾淤积性海岸，潮间带为淤泥充填。滩涂湿地平坦开阔，底质为粘泥沙质，沉积层较厚，滩涂土壤有机质含量丰富，土壤盐度约为0.88%～1.55%，成土母质为新浅海沉积物。试验田块土壤的基本理化性状(平均值)：pH值7.4、速效钾146.574 mg·kg-1、有机质20.274 g·kg-1、 有效磷64.031 mg·kg-1、全氮1.285 g·kg-1。

1.2 试验设计

试验田块种植西兰花已经有30年历史，2008年以前一直是西兰花连作田块，2008年以后开始轮作试验。共设西兰花-早稻水旱轮作(简称水旱轮作)、西兰花-南瓜旱旱轮作(简称旱旱轮作)、西兰花连作(简称连作)3种不同的种植方式。每种种植方式3次重复，随机区组排列，每小区面积60 m2，株行距为0.5 m×0.5 m，栽植密度为34 500株·hm-2。各小区田间管理措施与大田生产相同，施肥水平为：45%复合肥(N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15)1 200 kg·hm-2(分别于9月20日、11月5日均施600 kg·hm-2)、尿素750 kg·hm-2(分别于9月20日施150 kg·hm-2、10月30日施300 kg·hm-2、11月25日施150 kg·hm-2、12月20日施150 kg·hm-2)、氯化钾112.5 kg·hm-2(分别于9月20日施45 kg·hm-2、10月30日施37.5 kg·hm-2、11月25日施30 kg·hm-2)、硼砂30 kg·hm-2(分别于9月20日施15 kg·hm-2、11月25日施15 kg·hm-2)。

于2019年3月18日西兰花刚采收后土壤微生物较为活跃的时期进行西兰花根际土壤采样。采用5点取样法采集土样，在每小区采用对角线法选取5个点。取土前先清除地表植物和覆盖物，然后采取抖落法[21]进行西兰花根际土壤样品的采集，即将西兰花根系从土壤中拔出后，轻轻抖落掉与根系松散结合的土粒，收集大约在2 mm范围内与根系紧密结合的土壤。将各样地采集的土壤样品混合均匀，过2 mm网筛。称10 g土样装入无菌聚乙烯封口袋中，放入冰盒中低温运输至实验室，-20℃低温保存，用于高通量测序。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 土壤细菌基因组DNA提取 准确称取0.1 g土样，采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit试剂盒法(D5625, 美国Omega公司)，提取土样的总DNA。经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，同时采用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计(美国NanoDrop公司)对DNA进行定量测定。各样品的5份DNA样品随机取3份等量混均，分别制成3个平行样品，于-20℃保存备用。

1.3.2 PCR扩增及高通量测序 参考Caporaso等[22]的方法，通过细菌16S rDNA V3-V4区段引物来扩增各样品，使用的上下引物分别为338F (A C T C C T A C G G G A G G C A G C AG)和806R(G G A C T A C H V G G G T W T C T A AT)，对16S rDNA基因的(V3-V4)进行PCR扩增[23-25]。DNA扩增的反应条件为：98℃预试变性30 s，98℃变性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环35次；然后72℃延伸10 min。

使用质量体积比为2%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行检测，根据电泳初步定量结果，使用Qubit荧光定量系统(美国Lifetechnologies公司)对纯化后PCR产物进行检测定量，再根据各样本的测序量要求按相应比例混合，然后构建MiSeq文库，Illumina上机测序[26-27]。上机进行16S rDNA V3-V4区高通量测序，由杭州联川生物技术有限公司对16S rDNA基因的PCR产物完成测序工作，测序仪器是Illumina公司的Miseq测序仪[28]。

使用Prinseq软件对测序结果中read1、read2的3端进行质控，将质量低的数据截掉，以提高后续序列融合比率。

1.4 数据分析

采用Flash v1.2.8软件组装双端计数，根据双端序列的overlap关系，将序列拼接(merge)成长的tag，并将序列上建库引入的barcode和引物序列去除，而后再使用Vsearch(v2.3.4)软件对拼接序列进行质量过滤。预处理之后的clean data使用Vsearch将序列相似性大于97%的clean tags定为一个OTU，挑选最佳的centroids(位于几何中心)序列作为该OTU的代表序列。使用Blast进行序列比对，将OTU代表序列与RDP(核糖体数据库)以及NCBI-16S数据库对每个代表性序列进行物种注释。其他图片均是使用R包(V3.2.5)实现[29]。

2 结果与分析

2.1 不同种植方式对西兰花产量的影响

由图1可知，3 种种植方式中，以水旱轮作的西兰花产量最高，为28 620 kg·hm-2，其次是旱旱轮作，为27 180 kg·hm-2， 而以连作的产量最低，为26 850 kg·hm-2。 水旱轮作的西兰花产量显著高于连作(P<0.05)，也显著高于旱旱轮作(P<0.05)，但旱旱轮作与连作的产量差异并不显著。

图1 3种种植方式下西兰花产量

2.2 不同种植方式根际土壤细菌alpha多样性分析

MiSeq测序所得样品数据经质检后，所有样品获得的细菌有效序列总数为131 470。由表1可知，根际土壤细菌有效序列以西兰花连作最高，其次是旱旱轮作，而水旱轮作的西兰花根际土壤细菌有效序列最低，各处理的有效序列比例均大于82%。序列长度在300～400 bp和400～500 bp之间的分别占32.02%和65.72%，总计大于97%，满足分析要求。

经质控且去除嵌合体后，所得有效序列以97%的一致性聚类成OTUs，3种种植方式西兰花根际土壤细菌的OTU数为4 236 ～ 4 958个，共计8 190个，其中以旱旱轮作的OTU数最多，其次是连作，水旱轮作的OTU数最少(表1)。3种种植方式西兰花根际土壤细菌共有的OTU数是3 856个，占总数的47.1%。这是由于3种种植方式的西兰花根际土壤均是发育于相同的滩涂湿地围垦土壤母质上，因此各轮作方式特有的OTU数占总OTU数的比率较低。如水旱轮作西兰花根际土壤细菌特有的OTU数为794个，占总数的9.7%，旱旱轮作特有的OTU数为198个，占总数的2.4%，连作特有的OTU数为246个，占总数的3.0%，以水旱轮作西兰花根际土壤细菌特有的OTU数最高，可能是水旱轮作西兰花根际土壤由于发育条件较好，所以其细菌OTU数较多。

稀释曲线可以反映样品的取样深度，能够评价测序量能否覆盖所有类群。由图3可知，3种样品稀释曲线均趋于平缓，文库的覆盖率均已超过91%，说明取样基本合理，样本的OTU覆盖度已经饱和，本次测序深度可以反映台州湾滩涂围垦区3种不同种植方式西兰花根际土壤细菌群落的真实情况。

采用QILME软件计算样品的Chaol指数和Shannon指数用以表征其丰富度和多样性，Chaol指数和Shannon指数越大，表示细菌群落丰富度和多样性越高。由表2可知，不同种植方式西兰花根际土壤细菌群落Chaol和Shannon指数存在明显的不同，Shannon指数和Chaol指数均以水旱轮作最高，分别为10.60和5 480.77，其次是旱旱轮作，其Shannon指数和Chaol指数分别为10.33和5 206.03，以连作土壤的Shannon指数和Chaol指数最低，分别为10.20和5 032.95。 水旱轮作土壤细菌群落的Shannon指数和Chaol指数均显著高于旱旱轮作和连作，但旱旱轮作土壤细菌群落的Shannon指数和Chaol指数均与连作无显著差异。

2.3 不同种植方式西兰花根际土壤细菌的群落结构组成

测序结果通过物种注释，所得土壤细菌共有28个门，92个纲，167个目，301个科，691个属。测序结果表明，变形菌门(Proteobacteria，37.81%～48.08%)、酸杆菌门(Acidobacteria，14.36%～15.07%)、放线菌门(Actinobacteria，7.33%～16.74%)是台州湾滩涂围垦地3种种植方式西兰花根际土壤细菌的优势菌群。不同种植方式西兰花根际土壤细菌群落中，相对丰度次高的门类有芽单胞菌门(Gemmatimonadetes，4.41%～7.62%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，5.51%～6.40%)、绿湾菌门(Chloroflexi，3.21%～5.41%)、蓝细菌门(Cyarobacteria，2.57%～3.81%)、厚壁菌门(Firmicutes，1.39%～2.08%)、硝化螺旋菌门(Nitrospira，0.99%～1.69%)、疣微菌门(Verrucomicrobia，0.77%～1.02%)。另外，结果中未分类细菌的相对丰度为4.22%～6.46%。

表1 不同种植方式西兰花根际土壤细菌有效序列读数及OTUs数

表2 不同种植方式西兰花根际土壤细菌Alpha多样性比较

图2 OTU venn 分析结果

图3 相似度为97%的各土壤样品细菌稀释曲线

图4 门水平西兰花根际土壤细菌群落结构

在上述的优势菌群中，变形菌门以水旱轮作的相对丰度最高，为48.08%，其次是连作，为38.94%，以旱旱轮作的相对丰度最低，为37.81%，水旱轮作的相对丰度比连作和旱旱轮作分别增加了9.14个百分点和10.27个百分点，差异均达显著水平(P<0.05)。酸杆菌门以水旱轮作的相对丰度最高，为15.07%，其次是旱旱轮作，为14.82%，以连作的相对丰度最低，为14.36%，但三者之间差异均未达显著水平(P>0.05)。放线菌门以旱旱轮作的相对丰度最高，为16.74%，其次是连作，为16.08%，以水旱轮作的相对丰度最低，反为7.33%，水旱轮作与连作、旱旱轮作的差异达极显著水平(P<0.01)，但旱旱轮作与连作差异未达显著水平(P>0.05)。

在相对丰度次高的细菌门中，芽单胞菌门以连作的相对丰度最高，为7.62%，其次是旱旱轮作，为7.58%，以水旱轮作的相对丰度最低，只有4.41%，前二者与水旱轮作的差异达极显著水平(P<0.01)。拟杆菌门以连作的相对丰度最高，为6.40%，其次是旱旱轮作，为5.66%，以水旱轮作的相对丰度最低，只有5.51%，差异未达显著水平(P>0.05)。绿弯菌门以水旱轮作的相对丰度最高，为5.41%，其次是旱旱轮作，为3.67%，以连作的相对丰度最低，只有3.21%，水旱轮作与旱旱轮作、连作的差异均达显著水平(P<0.05)。蓝细菌门以连作的相对丰度最高，为3.81%，其次是旱旱轮作，为3.75%，以水旱轮作的相对丰度最低，只有2.57%，但差异未达显著水平(P>0.05)。

微生物结构热图可以反映不同样品间的物种组成和差异[20，30]。由图5可知，在门水平上3种种植方式西兰花根际土壤细菌的群落结构组成表现为旱旱轮作与连作相似，而水旱轮作和另外2种种植方式的相差较大。

从纲水平上看，3种种植方式西兰花根际土壤细菌中均以α-变形菌纲(Alphaproteobacteria，13.44%～14.84%)占优势，相对丰度最高的是连作的根际土壤，为14.84%，其次是水旱轮作，为13.49%，旱旱轮作的相对丰度最低，为13.44%，但差异均未达显著水平(P>0.05)。3种种植方式根际土壤中放线菌纲(Actinobacteria)也是优势菌纲，其相对丰度为7.07%～15.76%，以旱旱轮作的相对丰度最高，为15.76%，其次是连作，为15.15%，以水旱轮作最低，只有7.07%，远低于旱旱轮作连作，差异均达极显著水平(P<0.01)。γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria，8.58%～11.74%)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria，8.27%～13.88%)也是优势菌纲，但相对丰度远低于α-变形菌纲和放线菌纲。

图5 门水平上西兰花根际土壤细菌群落结构组成热图

图6 纲水平西兰花根际土壤细菌群落结构

其他菌纲根据其相对丰度从高到低依次为芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes，4.39%～7.51%)、酸杆菌纲(Alidobacteria-C7P6，5.22%～6.88%)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria，5.44%～8.57%)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria，2.69%～2.94%)。不同种植方式西兰花根际土壤细菌群落中，厌氧绳菌纲的相对丰度以水旱轮作最高，为2.25%，远高于旱旱轮作的1.03%和连作的0.58%，差异达极显著水平(P<0.01)。硝化螺旋菌纲(Nitrospira)的相对丰度同样以水旱轮作最高，为1.69%，与其他2种种植方式西兰花根 际土壤的差异达显著水平(P<0.05)。

3 讨论

土壤微生物与植物根系相互作用，共同构成植物根际土壤生态系统，其中，植物根系能够分泌各种有机化合物，促进或抑制微生物的生长和繁殖，致使植物根际土壤微生物的群落结构和多样性产生变化[19,31-32]。作物轮作特别是水旱轮作种植方式能使土壤中聚集多种植物残体，以及多种不同的植物根系分泌物，使土壤中微生物生长和繁殖所需要的营养成分丰富且平衡，从而增加土壤微生物的群落多样性[33]。另外，在水旱轮作条件下，土壤微生物在嫌气条件下有利于形成腐殖质，在好气条件下有利于产生CO2等气体，有助于形成具有良好团粒结构的土壤[34]，便于更多种类微生物的栖息繁殖。本研究中，水旱轮作田块西兰花根际土壤细菌群落 Chaol 指数和 Shannon 指数比西兰花连作田块分别提高了8.90%和3.92%，比旱旱轮作的田块分别提高了5.28%和2.61%。两种轮作田块的细菌群落 Chaol指数和 Shannon 指数均高于连作田，这与前人的研究结果一致[7, 33]。本研究结果更进一步说明了水旱轮作田块土壤细菌群落的 Chaol指数和 Shannon 指数均高于旱旱轮作田块。本研究中，产量分析结果表明，与连作相比，轮作具有增加西兰花产量的作用，其中水旱轮作和旱旱轮作的西兰花产量均较连作增加，且水旱轮作的增产效果高于旱旱轮作与连作。

农田生态系统中所种植的作物种类会对其根际土壤细菌群落结构组成产生影响[34]。轮作模式中由于作物种类的增加，造成作物根际土壤细菌群落结构组成发生了变化，这有利于形成优化的作物根系微生态环境，有利于缓解作物连作障碍[35]。梁志婷等[34]研究了陇东旱塬区不同粮草轮作模式下土壤细菌群落组成特征，发现轮作模式下作物根际土壤细菌变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门的丰度较高，为优势菌门。孙倩[35]在宁夏中部干旱带以谷子连作为对照，研究谷子-大豆、谷子-籽粒苋、谷子-藜麦轮作模式下谷子根际土壤细菌群落组成的变化情况，发现轮作模式下谷子根际土壤细菌变形菌门、绿湾菌门、酸杆菌门的相对丰度比连作条件下显著增加。变形菌门包含了多种可以进行固氮作用的细菌。绿湾菌门细菌能促进土壤有毒物质的降解[9]。酸杆菌门细菌能够降解土壤中纤维素和木聚糖等复杂的碳水化合物，具有丰富的遗传和代谢多样性，对农田生态系统的平衡和稳定起着重要作用。本研究结果也表明轮作方式下西兰花根际土壤细菌变形菌门、绿湾菌门、酸杆菌门菌群的相对丰度均大于连作西兰花根际土壤，这与上述学者的研究结果相一致。本研究更进一步说明了旱旱轮作条件下西兰花根际土壤绿湾菌门、酸杆菌门的相对丰度均比连作西兰花根际土壤提高0.46个百分点，但均未达显著水平；而水旱轮作条件下西兰花根际土壤细菌除了酸杆菌门与连作西兰花根际土壤相比略有提高但未达显著水平外(提高幅度为4.49%)，变形菌门和绿湾菌门菌群的相对丰度分别显著提高9.14和2.20个百分点。

土壤中放线菌门细菌能促进作物生长素的合成并分泌抗生素，进而促进作物生长并拮抗作物病害，但在不同轮作模式中作物根际土壤放线菌门细菌的相对丰度相差较大。本研究结果表明，在南瓜-西兰花旱旱轮作条件下，西兰花根际土壤放线菌门相对丰度高于西兰花连作田块，增加0.68个百分点，但未达显著水平。但在水稻-西兰花水旱轮作条件下，西兰花根际土壤放线菌门相对丰度明显低于西兰花连作田块，降低8.75个百分点，达极显著水平。这是因为放线菌是好气性微生物，而水稻-西兰花水旱轮作体系中，有一段时期农田处于淹水状态而不利于放线菌门细菌生长，导致其相对丰度降低[36]。

厌氧绳菌纲(Anaerolineae)具有降解土壤中碳水化合物和其他细胞材料(包括氨基酸)的作用[37]。在本研究3种种植方式中以水旱轮作西兰花根际土壤厌氧绳菌纲的相对丰度最高，与另2种种植方式西兰花根际土壤的差异均达极显著水平。硝化螺旋菌纲(Nitrospira)可将土壤中亚硝酸盐氧化成硝酸盐，参与土壤氮循环[38]。本研究中水旱轮作西兰花根际土壤硝化螺旋菌纲的相对丰度在3种种植方式中最高，与另2种种植方式西兰花根际土壤的差异均达显著水平。上述2个菌纲的相对丰度均以水旱轮作为最高，其次是旱旱轮作，而以连作为最低，说明轮作方式能够促进农田生态系统中有机物分解和氮素营养循环，在平衡作物营养方面发挥着重要作用，且水旱轮作对农田生态系统的优化效应要好于旱旱轮作。

4 结论

研究结果表明，在浙江省台州湾滨海滩涂地西兰花种植区，变形菌门、酸杆菌门、放线菌门是西兰花根际土壤细菌的优势菌群。相对丰度次高的门有芽单胞菌门、拟杆菌门、绿湾菌门、蓝细菌门、厚壁菌门、硝化螺旋菌门、疣微菌门。与西兰花长期连作相比，水旱轮作能提高西兰花根际土壤细菌变形菌门、酸杆菌门和绿湾菌门的相对丰度，降低西兰花根际土壤细菌放线菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门和蓝细菌门的相对丰度。水旱轮作和旱旱轮作均能改善台州湾滨海滩涂地区西兰花根际土壤细菌群落结构，但水稻-西兰花水旱轮作更能增加西兰花根际土壤细菌有益菌丰度，提高其根际土壤细菌多样性指数，有利于改善西兰花根际土壤生态环境。本研究为确立滨海滩涂地围垦区西兰花的适宜轮作方式提供了理论依据。今后应着重进行水旱轮作条件下作物根际土壤的理化性状、土壤酶活性的周期性变化规律及其与土壤微生物群落结构以及多样性指数的相关性研究，从资源高效利用和农业面源污染控制的角度，优化肥水管理技术，改善作物根际的微生态环境，建立水旱轮作方式的管理技术体系，以实现滨海滩涂地农作物优质高产和可持续发展的目标。