干旱胁迫对藜麦幼苗组织解剖结构和生理特性的影响

赵红梅 邓素芳 杨艳君 冀爱青 李洪燕

(晋中学院生物科学与技术学院，山西 榆次 030600)

干旱是影响植物生长发育、分布及产量的重要逆境因子之一，植物通常可以通过形态反应、调整细胞代谢和启动各种防御机制来应对干旱胁迫[1]。Lee等[2]研究表明水稻可通过增加根系导管数量来协助植株抵御干旱条件。Chimungu等[3]研究认为玉米可通过减少根系皮层细胞降低代谢消耗，以提高水分利用率。陈文妃等[4]研究表明黄瓜幼苗在轻度干旱胁迫下会出现根皮层薄皮细胞减少、茎木质部导管萎缩及叶片栅栏组织排列紧密等组织结构的变化。刘忠静等[5]研究发现干旱胁迫下由于叶片产生过量的活性氧从而导致叶片栅栏组织和海绵组织排列疏松。表明不同植物叶片组织结构对干旱胁迫的响应不同。脯氨酸作为“渗透保护剂”，其代谢过程是植物在干旱胁迫下重要的细胞代谢反应之一[6-7]。干旱胁迫下，植物体内积累大量脯氨酸，不仅可以防止细胞脱水，而且可以降低有毒离子含量[8-9]。另外，过氧化氢酶(catalase，CAT)、过氧化物酶(peroxidase，POD)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等抗氧化酶活性的提高也是解除植物活性氧(reactive oxygen species，ROS)危害的关键参与者，抗氧化酶可清除逆境胁迫产生的ROS，提高植物抗逆性[10-12]。

藜麦(ChenopodiumquinoaWild)是一种古老的具有遗传多样性的安第斯山脉类谷类作物，近年来由于其种子中的高蛋白含量与良好氨基酸组成等健康特性，以及其能适应不同环境(包括营养贫瘠的盐地和干旱胁迫的边缘农业生态系统等)碱抗逆特性[13]而备受国内外研究者的关注。目前关于藜麦营养价值和活性成分提取的研究报道较多[14-15]，而有关藜麦抗逆性的研究尚处于起步阶段，尤其对逆境胁迫下藜麦的不同组织形态及生理特性方面的研究较少。因此，本研究以藜麦幼苗为试验材料，探究不同组织根、茎、叶细胞结构对干旱胁迫的响应，并从胁迫下不同组织中脯氨酸含量及其相关酶活性变化、抗氧化物酶活性变化等方面探讨藜麦的抗旱机理，以期为藜麦品种选育、栽培管理及合理开发利用提供理论依据和指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试藜麦品种为华青一号，由山西省静乐县华青藜麦种子公司提供。该品种藜麦籽呈浅黄色，扁圆柱形，植株呈扫帚状，株高约180～220 cm，生育期110～120 d，属中熟品种，抗旱、耐瘠性较强，不耐高温和雨涝，中等抗倒伏，适宜在海拔1 000 m以上的旱源地区种植。

1.2 试验设计

1.2.1 藜麦幼苗的培育 选取颗粒饱满的藜麦种子，将其置于垫衬湿纱布的培养皿中，待发芽之后用镊子将其移至装有试验基地土壤的培育盆中，每盆种植8株，共27盆，并放置于生化培养箱，恒温25℃培养，采用称重法，确定每天的加水量维持所需田间持水量。待藜麦幼苗长至六叶一心期，进行干旱处理。试验设置3个不同田间持水量，分别为100%、50%、25%，并分别设置3个干旱处理时间，分别为0、48、96 h，采用完全随机区组设计，3次重复。

1.2.2 干旱处理 根据Earl[16]的方法并稍作修改。根据环刀法测定试验基地田间持水量约为40%，为保证实验室干旱处理条件的一致性，以带回的湿土量与干土量为基础，采用称重加水的方法控制不同的田间持水量，130 g湿土壤经烘干后测得干重为92.58 g，失去的水分为37.42 g，将该田间持水量设为100%，然后计算50%和25%田间持水量所需的水分，干旱处理时在同样的干土中加入计算好的水量，达到所需土壤的重量，分别为130 g(100%)、111.29 g(50%)、101.94 g(25%)，然后将藜麦幼苗移栽至不同处理中，每盆每天测量3次，及时补水保持重量不变。

1.3 测定项目与方法

田间持水量的测定：采用环刀法测定田间持水量，在试验基地选择挖掘的土壤位置，先用土刀修平土壤表面，按0.5 m的深度将环刀向下垂直压入土中，直至环刀筒中充满土样，然后用土刀切开环刀周围的土样，取出已充满土的环刀，细心削平刀两端多余的土，并擦净环刀外围的土，将其带回实验室。在环刀底端放2张大小合适的滤纸，纱布包好后用橡皮筋扎好。放在事先放有滤纸的盆中，注入清水，并保持盆中水的高度低于环刀上沿约1～2 mm，使环刀中土壤充分浸泡直至水分沿毛管上升而全部充满为止。取出装土环刀，去掉纱布和滤纸，取出一部分土壤放入已知重量的铝盒内称重得湿土重，然后放入105～110℃烘箱中，烘干至恒重后称重，得干土重。根据公式计算田间持水量：

田间持水量=[(湿土重-干土重)/干土重]×100%

(1)

组织解剖结构的观察：用流水洗净藜麦根系样品，滤纸吸干表面水分后，沿根尖5～6 cm处切成0.5 cm的小段；取藜麦茎秆中间部位将其切成0.5 cm的小段；沿叶片主脉处切取0.5 cm×0.5 cm的小片；标准固定液(Formalin-acetic acid-alcohol, FAA)固定，按照固定—脱水—透明—浸蜡—包埋—切片(厚8 μm)—贴片—烘干—染色(番红-固绿双重染色)—封片的步骤进行，采用RM2235切片机(德国Leica公司)切片，SA3300 PL生物显微镜(北京泰克仪器有限公司)观察、拍照。每个处理重复10次，每张样片选取5个视野。

生理指标的测定：脯氨酸含量的测定采用酸性茚三酮法[17]；吡咯啉-5-羧酸合成酶(pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)活性测定采用盐酸羟胺比色法[18]；脯氨酸脱氢酶(proline dehydrogenase，PDH)活性测定参照赵福庚等[19]的方法。POD活性测定参照Shi等[20]的方法；SOD活性测定参照Huang等[21]的方法；CAT活性测定参照Abei[22]的方法。

1.4 数据分析

采用 Microsoft Excel 2010处理数据和作图，图表中数据为平均值±标准差。用SAS 9.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析法(one-way ANOVA) 和LSD法进行不同处理间的方差分析和多重比较 (α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 藜麦幼苗根、茎、叶组织结构对干旱胁迫的响应

图1 不同田间持水量下藜麦幼苗根组织结构的变化

2.1.1 根组织结构对干旱胁迫的响应 由图1可知，田间持水量为100%时，随着处理时间的延长，根直径、根韧皮部厚度和根木质部厚度均呈稳定增长趋势。与100%田间持水量相比，除0 h外，同一处理时间下，随着田间持水量的降低，根直径与根表皮厚度总体呈逐渐增加趋势，最大分别增加了9.1%和64.9%；根韧皮部厚度和根木质部厚度则呈降低趋势，两指标最低可降低26.3%和30.3%。在50%和25%田间持水量条件下，随着处理时间的延长，根直径与根表皮厚度均呈逐渐增加趋势；根韧皮部厚度与根木质部厚度则呈先下降后上升的趋势。可见，藜麦根系在一定干旱胁迫下会变粗，并通过表皮变厚来防止脱水。

2.1.2 茎组织结构对干旱胁迫的响应 由图2可知，在田间持水量为100%时，随着处理时间的延长，茎直径、茎表皮厚度、茎木质部厚度、茎髓腔直径总体均呈增加趋势；而当田间持水量为50%和25%时，则呈下降趋势。在同一处理时间下，随着田间持水量的下降，各指标均呈逐渐下降趋势，其中，田间持水量为25%处理96 h后，各指标值最低，与100%田间持水量处理96 h相比，茎直径、茎表皮厚度、茎韧皮部厚度、茎木质部厚度、茎髓腔直径分别下降了27.2%、50.0%、38.6%、48.5%、55.6%。可见，一定程度的干旱胁迫影响了藜麦幼苗茎组织的生长发育。

2.1.3 叶片组织结构对干旱胁迫的响应 由表1可知，田间持水量为100%时，随着处理时间的延长，叶片厚度、上表皮厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、下表皮厚度均呈逐渐上升趋势；当田间持水量为50%和25%时，各指标则呈下降趋势。同一处理时间下，随着田间持水量的降低，各指标均呈下降趋势，且25%田间持水量处理96 h作各指标值最低，与100%田间持水量处理96 h相比，各指标分别降低了56.9%、57.2%、61.6%、59.5%、50.8%。可见，干旱胁迫程度的加深和处理时间的延长均会使叶片细胞结构逐渐受损。

由图3可知，田间持水量为100%时，随着处理时间的延长，藜麦幼苗叶片细胞结构仍保持完整，层次结构较清晰，排列整齐；当田间持水量为50%和25%时，随着处理时间的延长，叶片结构破损逐渐加重，其中，25%田间持水量处理96 h后叶片细胞结构破损最严重。同一处理时间下，田间持水量为50%时，叶片结构还相对较完整，叶片细胞结构受损不大，而当田间持水量降低至25%时，叶片结构损伤加重，尤以处理96 h后，叶片结构受损严重，叶片的下表层细胞与海绵组织细胞破损较多。可见，藜麦叶片细胞结构在适度干旱胁迫下还可保持较完整的细胞结构，但严重的干旱胁迫会导致叶片结构受损。

2.2 干旱胁迫对藜麦幼苗脯氨酸含量及脯氨酸代谢酶活性的影响

由表2可知，田间持水量为100%时，随着处理时间的延长，根、茎、叶组织中脯氨酸含量、P5CS活性呈上升趋势，PDH活性呈逐渐降低趋势；当田间持水量为50%和25%时，随着处理时间的延长，根、茎、叶中脯氨酸含量及P5CS活性以及叶和茎中的PDH活性与田间持水量为100%时趋势一致，但变化幅度明显增加，根中PHD活性在田间持水量为50%时，随着处理时间延长呈逐渐上升趋势，而在田间持水量为25%时，PDH活性呈先增后降的趋势。同一处理时间下，随着田间持水量的下降，根、茎、叶中脯氨酸含量和P5CS活性总体显著增加，PDH活性则在各组织中表现不同，叶和茎中呈逐渐下降趋势，而根中PDH活性在处理48 h随着田间持水量的下降表现为逐渐上升趋势，96 h后则呈先升后降的趋势。可见藜麦幼苗不同组织在干旱胁迫下脯氨酸代谢相关酶活性表现不同。

图2 不同田间持水量下藜麦幼苗茎组织结构的变化

表1 不同田间持水量下叶片组织结构的变化

注：a～c：100%田间持水量处理0、48、96 h；d～f：50%田间持水量处理0、48、96 h；g～i：25%田间持水量处理0、48、96 h；up：上表皮；le：下表皮；lp：栅栏组织；ls：海绵组织。

表2 不同田间持水量下藜麦幼苗不同组织脯氨酸含量、P5CS活性、PDH活性变化

2.3 干旱胁迫对藜麦幼苗不同组织抗逆性酶活性的影响

由表3可知，各田间持水量根中SOD、POD和CAT活性均随处理时间的延长呈上升趋势；当田间持水量为100%和50%时，随处理时间的延长，叶中3种酶活性呈逐渐上升趋势，茎中SOD和POD活性与叶中趋势相同，而茎中CAT活性仅在田间持水量50%时呈上升趋势；当田间持水量为25%时，茎和叶3种酶活性则表现为先升高后降低的趋势。处理48 h后，随着田间持水量的下降，不同组织中SOD、POD和CAT活性均呈上升趋势；处理96 h后，根中3种酶活性仍呈逐渐增加趋势，而叶和茎中3种酶活性则随着田间持水量的增加呈先升高后降低的趋势。

表3 不同田间持水量下藜麦幼苗不同组织SOD、POD、CAT活性变化

3 讨论

干旱胁迫可影响植物形态特征和生理特性，从而导致其生长缓慢及产量降低[12,23]。已有研究表明，植物各器官组织对干旱胁迫的反应不同[24-26]。本研究结果表明，藜麦幼苗根、茎、叶对干旱胁迫的响应也有所不同，其中藜麦的根直径和表皮厚度随着田间持水量的降低反而增加，这可能因为根是与土壤直接接触的器官，是接收土壤水分亏缺信号的首要部位，藜麦抵御干旱首先会通过增加根粗来体现，这与前人的研究较为一致[27]；由于藜麦根对干旱胁迫的抵御，茎和叶在一定程度的干旱胁迫下仍能保持细胞结构的完整性，但随着干旱程度的不断加深和持续时间的延长，藜麦茎秆输送水分能力降低，从而使叶片缺水严重，叶细胞结构最终遭到破坏，表明藜麦虽可以抵御一定程度的干旱，但严重的水分亏缺仍会影响其生长发育。

干旱胁迫下，植物除形态结构改变外，也会通过一系列的分子和生理生化机制来减轻干旱带来的危害。脯氨酸作为膜稳定的渗透保护剂，是在胁迫条件下维持细胞水分含量的重要有机溶质之一。大量研究已表明，干旱胁迫下植物体内脯氨酸含量会大量增加[28-29]。本研究结果表明，随着田间持水量的降低和处理时间的延长，藜麦幼苗根、茎、叶中的脯氨酸含量均呈增加趋势，其中，由于叶片对水分亏缺最为敏感，也是亏缺最严重的组织，其脯氨酸的积累量最高，其次是茎和根，这与前人报道的藜麦幼苗叶片脯氨酸含量在干旱胁迫下会大量增加的结果较为一致[30]。前人研究认为，在干旱胁迫下脯氨酸的合成和分解主要由吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和脯氨酸脱氢酶(PDH)参与进行[31]。P5CS是脯氨酸合成的限速酶，在盐胁迫或脱水条件下具有重要的渗透调节作用[32]。由本研究结果可知，干旱胁迫下根、茎、叶中P5CS活性均提高，从而导致大量脯氨酸的合成，但在叶中25%田间持水量条件下处理96 h后，由于叶细胞结构被逐渐破坏，P5CS活性也较50%田间持水量处理有所降低；而茎和根受损程度小于叶，因此这两种组织中P5CS仍能在严重的干旱胁迫下(25%田间持水量)维持较高的活性；PDH活性则表现为在根中高活力而在叶和茎中被抑制，表明干旱下藜麦幼苗脯氨酸代谢具有组织特异性，根中PDH的高活性可能也是藜麦幼苗抵御干旱的一种机制。

植物细胞在胁迫下会激活抗氧化防御系统来抵御干旱，在这一体系中，抗氧化酶如SOD、POD、CAT是最活跃、最有效的抗氧化应激保护机制[33]。随着田间持水量的降低及处理时间的延长，藜麦根、茎、叶中SOD、POD和CAT活性逐渐增加，这与早期在不同作物中报道的结果较为一致[34-36]；此外，根中3种酶的稳定性高于茎和叶，这可能是因为植物的水分主要来源于根系，其耐受力高于茎和叶的缘故。

4 结论

藜麦幼苗根、茎、叶3种组织解剖结构对于干旱胁迫的响应不同。藜麦幼苗可通过增加根粗及根表皮厚度来抵御一定的干旱；干旱胁迫下藜麦幼苗3种组织中脯氨酸含量及P5CS活性均会提高，且叶中脯氨酸积累量高于茎和根，而PDH活性则在根中较高，在叶和茎中被抑制；此外，干旱胁迫下藜麦幼苗3种组织中抗氧化酶活性的提高也进一步增强了其抗旱性。本研究结果表明，藜麦幼苗可抵御田间持水量为50%时的干旱胁迫，该结果可为藜麦的栽培种植提供理论借鉴。