免疫蛋白酶体抑制剂PR957对DOCA-高盐高血压小鼠肾脏纤维化的保护作用

鄢雯 李囡 王世全 曾令娥 刘立新

(首都医科大学燕京医学院临床医学学系,北京 101300)

肾脏纤维化是高血压引起靶器官损伤的重要病理变化，主要由于大量胶原蛋白沉积，最终取代正常肾脏结构，导致肾小球硬化及肾小管间质的纤维化，造成肾脏功能进行性丧失[1-2]。泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)是真核细胞内调节蛋白质降解的主要途径之一。β5i是UPS蛋白酶解中心的核心催化亚基[3]，可产生糜蛋白酶样活性。我们发现免疫蛋白酶体亚基β5i参与盐敏感型高血压的小鼠心肌重构的病理过程[4]，但其在肾脏纤维化的作用尚不甚清楚。本研究通过建立醋酸脱氧皮质酮(desoxycorticosterone acetate,DOCA)-盐敏感高血压模型，以特异性蛋白酶体抑制剂PR957进行治疗，通过对小鼠血压及肾组织纤维化指标表达变化的研究，观察和分析β5i对DOCA-盐敏感型高血压小鼠肾脏纤维化的影响。报告如下。

1 材料和方法

1.1实验动物 C57BL/6J小鼠，雄性，8～10周龄，体重(23±2)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2012～0001。遵照首都医科大学生物医学伦理委员会实验动物相关伦理标准，实验前采用普通饲料适应性喂养小鼠1周，实验期间小鼠自由饮水和进食。

1.2实验试剂和仪器 (1)主要试剂为：DOCA(Sigma)；PR-957(Selleck Chemicals)；总RNA提取及及TaKaRa逆转录试剂盒(Promega)；Trizol(Invitrogen)；SYBR Green(TaKaRa)；Masson三色染色试剂盒(Solarbio)。(2)主要仪器为：BP 98A鼠尾套管血压计(Softron)；real-time聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)仪(Bio-Rad)；TP1020半封闭全自动组织脱水机(Leica)。

1.3方法

1.3.1动物模型复制及分组 根据实验设计，将C57BL/6J雄性小鼠随机分为四组(每组n=8)：假手术组，PR-957组，DOCA-salt组和DOCA-salt+PR-957组。模型制备步骤[5]：(1)三溴乙醇(12 ml/kg)腹腔注射麻醉小鼠，在位于脊柱左侧肋缘下1 cm处作一长约1 cm的切口，暴露肾脏，结扎肾门处血管，剥离肾被膜，切除左肾后缝合肌肉和皮肤；(2)植入DOCA药片前一天，PR-957组和DOCA-salt+PR-957组皮下开始注射PR-957(12 mg/kg，每周4次)，其余两组皮下注射DMSO与生理盐水的混合液；(3)肾脏切除2天后，DOCA-salt组和DOCA-salt+PR-957组在右肩背部皮下植入DOCA药片并饮用含0.9% NaCl和0.2% KCl的高盐水3周，其余两组正常饮水；(4)术后，每隔2天在固定时间进行鼠尾套管血压测定。

1.3.2血压测量 采用BP-98A鼠尾套管血压仪进行血压测量。实验前1周在上午8～11点固定时间监测小鼠基础血压2次，以减少实验小鼠因紧张等不适造成的实验误差。在术后每隔2 d在相同时间进行血压测定，每只实验小鼠每次重复测量8～10遍血压，记录收缩压值并进行数据统计分析。

1.3.3肾脏取材 小鼠麻醉后，剪取小鼠肾脏，用滤纸吸干肾脏表面的水分称重并记录，去掉包膜及周围脂肪组织,称重记录肾重/体重指数 (kidney weight/body weight,KW/BW) ,提RNA的肾脏组织用液氮冷冻后保存于-80℃冰箱。用4 %多聚甲醛固定肾脏，然后用石蜡包埋、切片，脱蜡后进行Masson染色和免疫组化分析。

1.3.4肾组织病理检查 将多聚甲醛固定的肾组织制成3 μm厚的石蜡切片，行HE及Masson染色，用显微镜观察并采集图像，Masson染色结果运用Image-Pro Plus 6.0软件扫描图像并分析胶原沉积情况。

1.3.5肾脏组织RNA的提取及RT-PCR 肾脏组织RNA的提取及RT-PCR实验方法见参考文献[6]。引物的设计及合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。见表1。

表1 引物序列

2 结 果

2.1各组小鼠血压情况 为了探讨PR-957对小鼠血压的影响，我们在造模前两天至造模后3周每隔2天进行血压测定。与Sham组相比，埋入DOCA药片和高盐饮食 4 d后，DOCA-salt组小鼠血压开始明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而DOCA-salt+PR-957组则明显降低DOCA-salt诱导的血压升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：DOCA-salt处理后，检测小鼠的动脉收缩压(Systolic Arterial Pressure)变化情况(n=8～10次)。*P<0.05与Sham组比较；#P<0.05与DOCA-salt组比较。图1 各组小鼠血压的变化

2.2各组小鼠肾脏体积和肾质量/体质量 与Sham组比较，DOCA-salt处理后肾脏体积和KW/BW比率增高明显，差异有统计学意义(P<0.05)，腹部皮下注射PR-957可明显抑制DOCA-salt诱导的肾脏体积和KW/BW比率增大，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：(A)DOCA-salt处理21 d后，肾脏大体照片；(B)DOCA-salt处理21 d后，各组小鼠的KW/BW比值(n=5-6)；*P<0.05与Sham组比较；#P<0.05与DOCA-salt组比较。图2 各组小鼠肾体积和肾质量/体质量比值

2.3肾组织病理改变 HE及Masson染色可见sham组小鼠肾小管结构清晰完整，肾小管上皮细胞排列整齐，基底膜完整,间质未见炎性细胞浸润；DOCA-salt组小鼠肾小管腔扩张明显，肾小管基底膜不规则增厚,肾小管上皮细胞出现空泡状改变,细胞萎缩和脱落，小管间质细胞增多伴有炎性细胞的浸润，间质区增宽，肾小管间质胶原沉积增多，差异有统计学意义(P<0.05) ；DOCA-salt+PR957组小鼠肾脏病变有不同程度的改善,肾小管间质胶原沉积明显减少，差异有统计学意义(P<0.05) ,炎性细胞浸润减轻,空泡状改变不明显。证实PR-957可以明显降低DOCA-salt引起的肾脏炎症反应和纤维化。见图3。

注：(A)DOCA-salt处理并腹部皮下注射PR-957后，肾脏组织进行Masson染色(×200倍)(B)DOCA-salt处理并腹部皮下注射PR-957后，肾脏组织进行HE染色(×200倍)。图3 各组小鼠肾组织病理学变化

2.4qPCR结果 与Sham组相比，DOCA-salt组小鼠肾组织纤维化因子Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和炎症因子ⅠL-1β、ⅠL-6、TNF-α的表达显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)；PR957干预后，胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、ⅠL-1β、ⅠL-6和TNF-α的表达较DOCA-salt组显著减少，差异有统计学意义(P<0.05) 。见图4。

注：(A)DOCA-salt处理并腹部皮下注射PR-957后， qPCR检测肾脏Collegen Ⅰ和CollegenⅢ水平。(B)qPCR检测肾脏炎症因子ⅠL-1β、ⅠL-6、TNF-α和MCP-1的mRNA水平(n=6)。*P<0.05与Sham组比较；**P<0.01与Sham组比较；#P<0.05与DOCA-salt组比较。图4 蛋白酶体抑制剂PR-957减轻DOCA-salt引起的炎症反应

3 讨 论

高血压病是目前临床上最常见的慢性病，盐敏感性高血压是原发性高血压的一种常见类型。DOCA为醋酸脱氧皮质酮，有醛固酮样的作用，DOCA盐敏感高血压模型类似于人类继发性高血压病的原发性醛固酮增多症，与水钠潴留、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活、血管活性肽物质增多等多种机制有关[7]。我国成人中患有原发性高血压病的患者约10%～15%会发展到慢性肾衰竭。在高血压患者中,体内血管内皮的炎症反应可以导致肿瘤坏死因子、血小板源生长因子的大量生成,诱导其变成单核细胞、纤维细胞,形成ⅠL-6,而ⅠL-6又能够增加纤维细胞、平滑肌细胞的表达,最终引发周围血管阻力的升高,导致疾病的产生[8]。长期的高血压会使肾小球处于高滤过和高灌注状态，进而导致系膜细胞增生硬化，局部肾小球及肾小管缺血、功能受损，导致肾小管间质炎性细胞浸润及肾小球纤维化等病理学改变[9]。

泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)是真核细胞清除蛋白质主要通路，参与调节细胞周期、基因转录、抗原呈递、细胞增殖与分化以及信号转导等多种生理过程。免疫疫蛋白酶体中β1i、β2i和β5i是催化亚基，其中β5i亚基由275个氨基酸组成，具有糜蛋白酶样活性，β5i作为免疫蛋白酶体的核心亚基，具有糜蛋白酶样活性，可以调节免疫炎症反应、氧化应激及提呈内源性抗原或病毒介导的MHC-Ⅰ限制性抗原[10]。最近研究发现了一种β5i亚基的特异性抑制剂，其活性成分为PR-957(ONX 0914)[11]。研究表明PR-957可抑制小鼠自身免疫和炎症相关性疾病[12]。我们既往研究证明在DOCA盐敏感型高血压小鼠心肌中β5i蛋白水平明显上调，而β5i抑制剂PR-957处理后可明显改善DOCA盐诱导的肾脏功能增高及心肌肥厚[4]。但是，PR-957在DOCA盐敏感高血压性肾脏纤维化的作用尚不清楚。

本实验结果表明免疫蛋白酶体抑制剂PR-957显著降低DOCA/盐引起肾小管-间质纤维化的发展和炎症因子( ⅠL-1β、ⅠL-6 和TNF-α) 的表达，提示PR957对DOCA-高盐高血压小鼠的肾脏损伤可以起保护作用。免疫蛋白酶体β5i 亚基可作为治疗高血压性肾脏损伤的一个潜在新靶点。但其深入的机制仍需要进一步研究。