胃癌中DNA甲基化对miR-200c 141表达组分析

张睿 张郭亮 王飞娟

(铜川市人民医院，1.肿瘤科;2.重症科,陕西 铜川 727000)

miRNA在肿瘤因子的萌芽、发展以及转归的过程中起着巨大的作用，为医学界对肿瘤的研究提供了新思路、新方向[1-2]。窦维佳等[3]研究中表明miR-200c与miR-141在结肠癌组织中具有增加癌细胞侵袭转移能力的作用。近年来，随着科技的迅速发展，对于肿瘤疾病的靶基因预测数据库的更新换代速度也在逐步加快，肿瘤疾病的研究也在不断深入[4]。然而，目前医学界仍尚未明确miR-NAs自身的调控机制[5]。近期有学者在研究中指出，DNA甲基化通过调节miR-200 c以及miR-141的水平对于一些肿瘤因子和正常细胞的表达起着重要的作用，但是在胃癌中表达的调控机制上不明确[6]。鉴于此，本次研究旨在为临床研究miR-200 c/141在胃癌中表达的调控机制提供参考依据。报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取我院2018年2月至2019年2月收治的58例胃癌患者纳入至本次调研中，所有患者均接受胃癌根治术治疗，且术前为接受任何放化疗或新辅助治疗。收集患者非坏死部分的肿瘤组织以及距肿瘤组织5 cm以上的癌旁组织作为检测标本，样本收集完成后全部放置在冻存管中进行保存。收集患者的相关病例资料，在收集的过程中发现有1例患者的数据资料遗漏，58例患者中男性45例，女性12例；年龄42～76岁，平均(54.73±2.56)岁。

1.2检测所用试剂 Trizol试剂、GoTaq® Hot Start Green Master Mix、GoTaq® qPCR Master Mix以及逆转录试剂盒均来自于上海玉博生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1PCR扩增 实验室检验人员按照GoTaq® Hot Start Green Master Mix的说明书进行操作，将通过亚硫酸盐处理后的DNA作为试验模板，进行PCR反应检测。检验结果显示miR-200 c/141-M(miR-200 c/141甲基化引物)上游引物为：5′-GTAAATCGGTGTGTGTCGCGGGTCG-3′；下游引物为：5′-CAAACCCTCCGAAACCCCTCGACCG-3′。miR-200 c/141-UM(miR-200 c/141非甲基化引物)上游引物为：5′-GTAAATTGGTGTGTGTTGTGGGTTG-3′；下游引物为5′-CAAACCCTCCAAAACCCCTCAACCA-3′。所有检测标本皆设置为空白对照，采用2.0%琼脂糖凝胶将PCR扩增产物进行电泳，观察软件扫描结果，判断甲基化率。

1.3.2实时荧光定量PCR 利用Trizol试剂提取胃癌组织或癌细胞中的RNA，并进行相关检测，利用逆转录试剂盒将miRNA或mRNA反转录为cDNA。然后根据GoTaq® qPCR Master Mix说明书中所提供的内容调配反应溶剂，然后根据PCR反应溶剂检测情况判断检测结果。检测中应用到的特异引物为：hsa-miR-200 c-RT：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGATCCATC；hsa-miR-200 c-Forward：GGCCTAATACTGCCGGGTAAT；hsa-miR-141-RT：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCATCT；hsa-miR-141-Forward：CCCGGGTAACACTGTCTGGTAA。

1.4观察指标 (1)观察并分析miR-200 c以及miR-141在胃癌组织中的表达水平情况；(2)统计所有胃癌患者标本中miR-200 c/141CpG岛的甲基化水平；(3)分析miR-200 c/141CpG岛的甲基化水平与miR-200 c以及miR-141之间的关系。

1.5统计学方法 采用SPSS21.0分析，计数资料miR-200 c以及miR-141在胃癌组织中的表达水平、所有胃癌患者标本中miR-200 c/141CpG岛的甲基化水平，经χ2检验，以%表示，差异有统计学意义为P<0.05。

2 结 果

2.1miR-200 c以及miR-141在胃癌组织中的表达水平情况对比 58例胃癌患者标本中(1例数据资料遗漏)，miR-200 c和miR-141的表达下调例数分别是44例、42例，占比为77.19%、73.68%，通过观察可知，较之于癌旁组织标本，胃癌组织中的miR-200 c和miR-141的表达有明显下降(P<0.05)。见图1。

图1 miR-200 c以及miR-141在胃癌组织中的表达水平情况对比

2.2所有胃癌患者标本中miR-200 c/141CpG岛的甲基化水平情况对比 58例胃癌患者标本中(1例数据资料遗漏)，miR-200 c/141CpG岛的甲基化水平上升的例数为47例，占比为82.46%；通过观察可知，较之于癌旁组织标本，胃癌组织中的miR-200 c/141CpG岛的甲基化水平有明显上升(P<0.05)。见图2。

图2 所有胃癌患者标本中miR-200 c/141CpG岛的甲基化水平情况对比

2.3miR-200 c/141CpG岛的甲基化水平与miR-200 c以及miR-141之间的关系 miR-200 c/141CpG岛的甲基化水平与miR-200 c/141表达水平为负相关关系。

3 讨 论

胃癌是临床上常见的消化道肿瘤，具有高发病率、高死亡率等特点[7]。近年来我国胃肠疾病患者的数量不断增加[8]。胃癌是胃肠疾病病变的终极表现，也是最有可能导致人体死亡的疾病，此外有研究表明胃癌手术有可能因手术时间长、感染等因素诱发重症肺炎、重症腹腔感染，且入住重症监护室(ICU)后还有较高风险发生ICU综合征，严重影响了患者的生命安全[9]。根据世界卫生组织(WTO)的调查结果显示，东亚地区是全球胃癌疾病的高发区域，其中我国胃癌病死率接近与全球胃癌死亡人口的五分之二[10-11]。因此，如何改善胃癌患者的治疗环境，降低胃癌患者的病死率成为我国乃至全球医学界需要重点研究的问题[12]。近几十年来，医学界的工作人员通过不断研究，发现了miRNAs在肿瘤的生长和发展过程中起着中要的作用，能有效抑制肿瘤因子的成长[13]。

作为一种小分子非编码RNA，miRNAs其种类多样，其中最常见的是miR-200，而miR-200 c、miR-141是miR-200组合中的重要组成部分，其主要分布在人体的第12常染色体上[14]。本次研究结果表明miR-200 c与miR-141在胃癌组织中的表达有明显的下降，这与李鹰飞等[15]研究报告中所述基本一致。这说明在胃癌疾病的生长发展过程中，miR-200 c与miR-141发挥着重要的作用，临床医生与学者可将miR-200 c与miR-141作为生物靶点，为患者提供有效的抗肿瘤治疗方案[16-17]。

随着医学界对miRNAs的深入研究中发现，人类miRNAs基因主要分布在染色体易位或染色体缺失的位置，且遗传学因素是影响miRNAs的重要因素，其中DNA甲基化是主要影响因素[18]。本次研究结果表明胃癌组织中的miR-200 c/141CpG岛的甲基化水平有明显上升，miR-200 c/141CpG岛的甲基化水平与miR-200 c/141表达水平为负相关关系，这与周欣亮等[19]人研究报告中所述基本一致。

BS-MSP方法是比较新颖的基因甲基化检测模式，具有耗时较短、检测速度快、实用性强、灵敏度高、特异性强等优点，可快速检测出CpG位点中甲基化的状况，在研究肿瘤相关表达调控机制中具有极大的现实意义，能够较好的获取CpG岛中的相关遗传学信息，使研究者可明确DNA甲基化在miR-200 c与miR-141中的作用[20-21]。

综上所述，在胃癌组织中，miR-200 c以及miR-141的水平随着miR-200 c/141CpG岛的甲基化水平的升高而降低。同时BS-MSP方法有利于研究者从分子水平领域探究胃癌疾病发展的病因，为临床诊治胃癌疾病提供依据和方向，可在临床中推广和广泛使用。