芦笋-灵芝发酵型饮料制备工艺研究

董玉玮，张浩赟，周立辉，沙 爽，陈学红，苗敬芝

（徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏 徐州 221018）

芦笋(Asparagus officinalis L.)又称石刁柏或者龙须菜，为百合科天门冬属。其种植地主要分布在江苏徐州、山东菏泽、山西运城等地，出口日本、韩国、马来西亚、澳大利亚、新加坡等国家[1]。芦笋具有低糖、低脂肪、高蛋白、高维生素等特点[2]，所含有的皂苷、多糖、黄酮类等活性物质在抗癌[3-4]、抗氧化、免疫调节等方面具有显著功效[5-6]。灵芝(Ganoderma lucidum)又称为瑞草，属灵芝菌科灵芝属，灵芝的有效成分是多糖、三萜类、腺苷等，具有安神、增强免疫力、抗氧化、美容养颜等功效[7-9]。灵芝多糖是灵芝中最重要的生物活性成分，具有保健功效，应用价值高，范围广[10]。

由于灵芝资源稀缺且人工栽培时间较长，限制了其药用价值的充分利用。随着药食真菌发酵技术的不断进步，可以通过液体发酵方式获得药食真菌活性成分。灵芝具有分解、利用纤维素和木质素的能力[11]，一些植物例如芦笋、牛蒡中除富含纤维素和木质素外[12]，还含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质等营养成分[13-14]，都可以作为灵芝生长的原料。因此制备芦笋-灵芝发酵型饮料，融合植物和药食真菌的优势，形成新型功能饮料，能够进一步开发芦笋和灵芝的价值。目前国内外市场畅销的饮料中，对人体健康有益的发酵饮料、药食真菌饮料比重较小，并且药食真菌饮料中直接采用子实体为原料的占比较大[15-16]，影响了药食真菌营养和功能的发挥，同时面临添加化学物质过多、功效单一、消费者人群局限等问题。因此植物-药食真菌发酵型饮料还具有很广阔的开发和应用空间。

该文以芦笋为主要原料，灵芝为发酵菌种，采用液体深层发酵技术，制备芦笋-灵芝发酵型饮料，能很好地保留灵芝的功效，同时芦笋中的一些营养成分被降解，形成新的有效成分和风味物质，为提升芦笋和灵芝深加工产品的科技含量和市场竞争力提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

绿芦笋：由徐州山崎农产品研发有限公司提供；赤灵芝菌种：实验室保存着的高活性灵芝菌种；柠檬酸：天津市北辰方正试剂厂；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、黄原胶：河南协恒生物科技有限公司；β-环状糊精：兰溪市科正生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯：天津市恒兴化学试剂股份有限公司。

1.1.2 仪器与设备

303-0S 恒温培养箱：常州金坛三和仪器有限公司；722 可见分光光度计：上海实验仪器商城；SW-CJ-1F紫外超净工作台：江苏力辰科技仪器；HH.S 恒温水浴锅：上海邦西仪器有限公司；XFS-280A 高压蒸汽灭菌锅：上海电安有限公司；80-2 低速离心机：上海邦西仪器有限公司；HYG 摇瓶培养柜：上海实验仪器商城；DGG-9076A 烘箱：上海力辰科技仪器；SRH2000-45高压均质机：上海申鹿均质机有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 培养基配制

PDA 斜面培养基：土豆洗净去皮切碎，准确称取200 g，加适量蒸馏水煮沸，弃渣取土豆汁。加入20 g 琼脂和20 g 葡萄糖，加水定容至1 000 mL，加热至100 ℃，混匀后装入试管，倾斜放置，冷却凝固。

液体培养基：将芦笋洗净粉碎，称取一定量置于250 mL 锥形瓶中，添加3 g 可溶性淀粉、1 g 酵母浸膏和100 mL 蒸馏水，高压灭菌后，取出冷却至室温。

1.2.2.2 灵芝菌种的活化与液体发酵

将灵芝菌种在无菌操作台内接入PDA 斜面培养基中，28 ℃培养箱培养5～6 d。挑选长势好的菌种，接种在液体培养基中，28 ℃，120 r/min 摇床发酵培养 6～8 d。

1.2.2.3 稳定、调配与均质

将培养好的发酵菌液倒入液体搅拌机，搅拌10 min，混合液于4 000 r/min 离心10 min，取上清液。加入适量的稳定剂（CMC-Na、黄原胶和β-环状糊精），测定沉淀率，加入调味剂（蔗糖、蜂蜜和柠檬酸），将料液在25 MPa、60 ℃条件下均质，处理后立即脱气。

1.2.2.4 灌装与杀菌

采用容积为100 mL 的玻璃瓶灌装均质后的饮料，110 ℃杀菌30 min，自然冷却。

1.2.3 稳定剂添加量的选择

1.2.3.1 CMC-Na 添加量

控制黄原胶和β-环状糊精的量不变，分别添加质量百分比为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的CMC-Na，混匀，静置12 h 以上，计算沉淀率，试验重复3 次，结果取平均值。

1.2.3.2 黄原胶添加量

控制CMC-Na 和β-环状糊精的量不变，分别添加质量百分比为 0.03%、0.04%、0.05%、0.06%和0.07%的黄原胶，混匀，静置12 h 以上，计算沉淀率，试验重复3 次，结果取平均值。

1.2.3.3 β-环状糊精添加量

控制CMC-Na 和黄原胶的量不变，分别添加质量百分比为0.20%、0.30%、0.40%、0.50%和0.60%的β-环状糊精，混匀，静置12 h 以上，计算沉淀率，试验重复3 次，结果取平均值。

1.2.3.4 沉淀率计算

将加入稳定剂的发酵菌液放入液体搅拌机，搅拌10 min，液体于 4 000 r/min 离心 10 min，取上清液，称取干燥离心管的质量为m1，量取10 mL 上清液加入离心管，再次称取质量为m2，4 000 r/min 离心20 min，弃上清液，称取沉淀物质量为m3，按照公式（1）计算沉淀率[17]。

1.2.4 调配剂添加量的选择

以蔗糖、蜂蜜和柠檬酸3 种调味剂作为单因素，进行感官评价，重复3 次，结果取平均值。

1.2.4.1 蔗糖添加量

控制柠檬酸和蜂蜜的添加量不变，分别加入质量百分比为2%、4%、6%、8%和10%的蔗糖量，混匀，静置1 d，进行感官评分。

1.2.4.2 蜂蜜添加量

控制柠檬酸和蔗糖的添加量不变，分别加入质量百分比为1%、1.5%、2%、2.5%和3%的蜂蜜量，混匀，静置1 d，进行感官评分。

1.2.4.3 柠檬酸添加量

控制蜂蜜和蔗糖的添加量不变，分别加入质量百分比为0.06%、0.08%、0.10%、0.12%和0.14%的柠檬酸，混匀，静置1 d，进行感官评分。

1.2.4.4 饮料调配Box-Behnken 试验设计

采用Design-Expert 8.07 软件，选取3 个调味剂因素：X1蔗糖、X2蜂蜜、X3柠檬酸，选择感官评价得分较高的3 个水平，进行响应面试验，因素与水平见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Design factors and levels of response surface experiment

饮料感官评价标准详见表2。邀请15 位具有一定食品感官评定基础的专业人员组成评定小组[18]对饮料进行感官评定，依照指标评分，以保证结果的准确性。

表2 芦笋-灵芝发酵饮料感官评价标准Table 2 Sensory evaluation of Asparagus officinalis-Ganoderma lucidum fermented beverage

1.2.5 饮料多糖的提取与含量检测

1.2.5.1 提取方法

参考潘明等[19]的方法。将培养后的发酵液于4 000 r/min 离心10 min，取上清液置于50 ℃烘箱中烘至原体积五分之一，再加入5 倍体积95%乙醇，于4 ℃冰箱中过夜醇沉后，4 000 r/min 离心5 min，取沉淀于50 ℃烘箱烘干，得粗多糖。

1.2.5.2 含量测定

参考周浓等[20]的方法，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。称取多糖纯品1 g，加水10 mL 彻底溶解，在490 nm 波长下测定吸光度值，根据标准曲线计算多糖含量。

1.2.5.3 葡萄糖标准曲线的制作

准确称取干燥至恒重的无水葡萄糖标准品0.50 g，配成浓度为0.1 mg/mL 的葡萄糖对照品储备液，分别准确吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置于 10 mL 比色管中，加蒸馏水补至1.0 mL，各加入5%苯酚溶液1.0 mL，混匀后快速加入5.0 mL 浓硫酸，混匀，冷却10 min，50 ℃水浴 20 min，室温冷却，在 490 nm 波长下测定葡萄糖标准溶液的吸光度，得标准曲线y=0.043 9 x-0.004 1，R2=0.999 6，在 0～100 μg/mL 范围内呈良好的线性关系。

1.2.6 数据处理

采用Design Expert 9 软件进行试验设计，利用Origin 9.0 软件处理数据并作图，所有数据用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 饮料稳定性试验结果

2.1.1 CMC-Na 添加量的确定

如图 1 所示，CMC-Na 添加量在 0.05%～0.25%时，沉淀率先下降后上升，当CMC-Na 添加量为0.15%时，沉淀率达到最低，为0.110%。关仁梅等[21]研究蓝莓红豆复合饮料发现，0.05%～0.15%的CMC-Na能够很好地发挥其稳定性和风味优势，与本试验结果基本一致。

图1 不同CMC-Na 添加量对发酵液沉淀率的影响Fig.1 Effects of different CMC-Na additions on sedimentation rates of fermentation broth

2.1.2 黄原胶添加量的确定

如图2 所示，黄原胶添加量在0.03%～0.07%时，沉淀率值先下降后升高，当黄原胶添加量为0.05%时，沉淀率值达到最低，为0.101%。代邵娟等[22]研究发现，对大樱桃苹果发酵饮料稳定性影响最大的是黄原胶，当添加量为0.08%时，稳定性最好，与本试验结果基本一致。

图2 不同黄原胶添加量对发酵液沉淀率的影响Fig.2 Effects of different xanthan gum additions on sedimentation rates of fermentation broth

2.1.3 β-环状糊精添加量的确定

如图3 所示，β-环状糊精添加量在0.2%～0.6%时，沉淀率先下降后上升。当β-环状糊精添加量为0.4%时，沉淀率达到最低，为0.107%。β-环状糊精不仅能够作为稳定剂，还可一定程度遮盖饮料的苦涩味，张蕾等[23]研究荷叶露保健饮料发现，当β-环状糊精用量为0.4%时，效果最佳，与本试验结果基本一致。

图3 不同β-环状糊精添加量对发酵液沉淀率的影响Fig.3 Effects of different β-dextrin additions on sedimentation rates of fermentation broth

根据上述结果，稳定剂添加量选择CMC-Na 为0.15%，黄原胶为0.05%，β-环状糊精为0.4%，此时测得的沉淀率值为0.098%。

2.2 饮料调配试验结果

2.2.1 蔗糖添加量的确定

添加最佳比例的稳定剂后，加入蔗糖，发酵型饮料感官评分见图4。如图4 所示，蔗糖添加量在2%～10%时，发酵型饮料的感官评分先增加后减小。当添加量低于2%或者高于10%时，饮料口味偏淡或过甜，风味不佳，评分很低。当蔗糖添加量为4%时，甜度适中，获得最高感官评分，95 分。

2.2.2 蜂蜜添加量的确定

图4 不同蔗糖添加量对饮料感官评分的影响Fig.4 Effects of different sucrose additions on sensory scores of beverage

添加最佳比例的稳定剂后，加入蜂蜜，发酵型饮料感官评分见图5。如图5 所示，蜂蜜添加量在1%～3%时，发酵型饮料的感官评分先增大后减小。当添加量低于1.0%或者高于3.0%时，口味淡或液体黏稠，风味不佳，评分很低。当蜂蜜添加量为2%时，饮料黏稠度适中，获得最高感官评分，96 分。

图5 不同蜂蜜添加量对饮料感官评分的影响Fig.5 Effects of different honey additions on sensory scores of beverage

2.2.3 柠檬酸添加量的确定

添加最佳比例的稳定剂后，加入柠檬酸，发酵型饮料感官评分见图6。如图6 所示，柠檬酸添加量在0.06%～0.14%时，发酵型饮料的感官评分先增大后减小。当添加量低于0.06%或者高于0.14%时，口味淡或偏酸，风味不佳，评分低。当柠檬酸添加量为0.10%时，酸度适中，获得最高感官评分，95 分。

图6 不同柠檬酸添加量对饮料感官评分的影响Fig.6 Effects of different citric acid additions on sensory scores of beverage

2.3 调味剂响应面试验结果

以芦笋-灵芝发酵型饮料感官评分为响应值，选取蔗糖、蜂蜜和柠檬酸添加量为主要因素进行响应面试验设计，试验方案与结果见表3。

表3 响应面试验设计和结果Table 3 Response surface experimental design and results

2.4 回归模型的构建与验证

通过响应面软件获得表4 数据，然后观察所得数据结果，分析、计算，再对 X1、X2、X3各因素回归拟合，最后可得到感官评分（Y）回归方程式（见式2）。

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

回归模型P＜0.01，达到了极显著水平，失拟项P＞0.05，不显著，即试验无失拟因素存在，能充分反映实际情况；决定系数R2=0.996，说明实际结果与模型预测结果的一致性良好说明结果有98.97%受试验因素影响。该模型拟合程度好，可以用该模型对芦笋-灵芝发酵型饮料制备工艺进行分析和预测。由回归方程和方差分析可知，模型中X2、X3对饮料感官评分的影响极显著（P＜0.01），X1对饮料感官评分的影响为显著（P＜0.05）。各因素对饮料感官评分影响的主次顺序为X2＞X3＞X1，即蜂蜜＞柠檬酸＞蔗糖。

2.5 两因素间交互作用分析

图7 表示各影响因素两两作用对芦笋-灵芝发酵型饮料感官评分的影响。在所选范围内各影响因素的相互作用存在极大值，既是响应面的最高点，同时也是等高线最小椭圆的中心点。由表4 数据分析可知，柠檬酸单独作用及其和蔗糖交互作用都会对饮料口感产生极显著影响（P＜0.01），蔗糖单独作用及其和蜂蜜交互作用会对饮料口感产生显著影响（P＜0.05）。蔗糖、柠檬酸、蜂蜜都能改变饮料风味，其本质是改变饮料的酸度和甜度。饮料的风味能够极大地影响消费者的口感，适合的甜度与酸度能够让饮料酸甜可口，从而获得更高的感官评价。

图7 两因素间交互作用响应面分析图和等高线图Fig.7 Response surface analysis and contour maps of interaction effects between every two factors

2.6 最佳条件优化及验证

回归模型确定的最佳制备工艺为：蔗糖添加量4.3%，蜂蜜添加量2.06%，柠檬酸添加量0.10%，感官评分的预测最大值达96.23 分。对此优化条件进行验证，考虑实际操作，选择蔗糖添加量4.15%，柠檬酸添加量0.10%，蜂蜜添加量2.09%的条件下进行3 次验证试验，得到的感官评分平均值为95 分，与预测结果基本相符，回归模型的预测性能较好，可用于芦笋-灵芝发酵型饮料制备工艺。最佳工艺条件为：稳定剂CMC-Na 0.15%，黄原胶0.05%，β-环状糊精0.4%，调味剂蜂蜜2.09%，柠檬酸0.10%，蔗糖4.15%，检测此时饮料多糖含量为3.262 mg/mL。

3 结论

（1）单因素试验表明：CMC-Na 添加量0.15%，黄原胶添加量0.05%，β-环状糊精添加量0.4%时，芦笋-灵芝发酵液的稳定性最好，沉淀率达到最低，为0.098%。

（2）响应面试验得出调味剂两两交互影响最大的是柠檬酸和蔗糖添加量。芦笋-灵芝发酵型饮料的最佳工艺条件为：蜂蜜2.09%，柠檬酸0.10%和蔗糖4.15%，该工艺条件下制备的饮料口感最好，感官评分为95 分，此时饮料多糖含量为3.262 mg/mL。