我国部分地区羊芽囊原虫流行病学调查

刘林科，王朋林，菅忆晨，李世杰，王占铭，王荣军，张龙现，宁长申，菅复春*

(1. 河南农业大学动物医学院，郑州 450046；2. 广西大学动物科学技术学院，南宁 530004)

芽囊原虫(Blastocystisspp.)是一种全球分布的原生生物，在人和动物体内都广泛存在，可以通过粪口途径、水、食物和直接接触传播[1]。芽囊原虫是导致腹泻、腹痛、肥胖、肠易激综合征、炎性肠病、荨麻疹的病原体之一[2-3]，但因人和动物感染后多无症状，其致病性仍存在一定争议[4-5]，另有研究表明，芽囊原虫通过与肠道菌群的相互作用对机体产生一定的影响，如颤螺菌属相对丰度的增加和梭菌属的减少[6]。芽囊原虫已被证明具有广泛的遗传多样性，迄今为止，根据SSU rDNA 序列的多态性进行基因亚型分类，已在人和动物中发现了22种不同亚型(subtypes，STs)，包括ST1～ST17、ST21和ST23～ST26[7]。ST1～ST9和ST12已在人类中被检测到，ST3是人类中最常见的亚型。除ST9外，其他亚型在动物中均有报道[8-9]。ST5主要来自家畜，而ST6和ST7是感染鸟类的主要亚型，ST8为非人灵长类(NHPs)的优势亚型。在人中偶然发现ST5至ST8亚型，这可能是人兽共患传播的证据[10-12]。迄今为止，ST10、ST11、ST13～ST17、ST21和ST23～ST26只在非人类宿主中被检测到[7,13]。

羊是重要的家畜之一，感染芽囊原虫后不仅会使其生产性能降低，而且会对周围环境和水源造成污染，对人们的健康有潜在威胁。为评估河南及其他省区的羊芽囊原虫感染情况，本研究基于芽囊原虫SSU rDNA位点进行分子流行病学调查和遗传特征分析，以期为我国人畜芽囊原虫病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2019年4月—12月，从河南(洛阳、商丘、郑州、开封、周口、南阳)、辽宁(朝阳)、青海、吉林(四平)、江苏(海门、徐州)、海南(澄迈、三亚)和贵州(贵阳)7个省份，共采集了704份新鲜羊粪便样本，每份样品分成3份，分别用于显微镜检测，DNA提取和长期保存(置于2.5%重铬酸钾溶液中4 ℃保存)。

1.2 DNA提取

使用粪便基因组DNA提取试剂盒(E.Z.N.A Stool DNA kit，OMEGA，America)进行粪便样品DNA的提取。取约200 mg粪便样品至2 mL离心管中，之后严格按照说明书步骤进行操作，最后将提取的样品置于-20 ℃保存。

1.3 PCR扩增与测序

基于芽囊原虫SSU rDNA位点，参照Scicluna 等[14]的方法对样品DNA进行PCR扩增。参照Stensvold 等[13]建立的方法对ST3和ST4进行 MLST(multilocus-sequence typing)多位点的PCR扩增。所有阳性样品PCR产物送至北京诺赛基因有限公司，用ABI PRISMTM3730 XL DNA测序仪进行测序。

1.4 序列及其系统发育分析

对测序结果进行拼接校对后，在NCBI中的GenBank数据库中进行BLAST检索比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。使用MEGA 7.0 (http://www.megasoftware.net)软件并采用邻接算法 (Neighbor-Joining，NJ)、自展值为1 000、Kimura-2参数模型基于芽囊原虫SSU rDNA序列构建种系发育系统进化树。此外，通过芽囊原虫序列分型数据库(www.pubmlst.org/blastocystis)对ST3和ST4的等位基因进行鉴定。

1.5 统计学分析

使用SPSS 22 版软件进行统计分析(http://www.winwrap.com/)。采用 χ2检验分析不同地区羊和不同品种羊之间芽囊原虫感染率的差异，P<0.05 表明差异显著，P<0.01表明差异极显著。

2 结 果

2.1 芽囊原虫感染率

在704份羊粪便样本中，芽囊原虫阳性样品为94份，总感染率为13.35%(94/704)。其中，河南、辽宁、青海、吉林、江苏、海南和贵州省的总感染率分别为17.61%(53/301)、27.27%(12/44)、21.43%(9/42)、 17.54%(10/57)、2.5%(3/120)、8.05%(7/87)和0(0/53)。各地区之间感染率差异极显著(P<0.01)，结果见表1。

表1 不同地区羊芽囊原虫的感染情况和亚型分布

本研究中共涉及8个山羊品种，感染率为11.11%(39/351)，6个绵羊品种，感染率为15.58%(55/353)。发现两品种之间感染率差异极显著(P<0.01)。 山羊中感染率最高的为绒山羊66.67%(2/3)，但样品量太少，不具代表性。其次为奶山羊和波尔山羊，感染率分别为16.67%(9/54)和16.48%(15/91)。努比亚山羊感染率为0，这是唯一没有检测到芽囊原虫的品种。绵羊中涉及的主要品种为湖羊，感染率为12.5%(26/208)，这与总体感染水平相当。

2.2 芽囊原虫亚型分型与系统发育分析

基于SSU rDNA位点通过NCBI的BLAST工具对各个地区羊源芽囊原虫序列进行分析发现，94份 芽囊原虫阳性样品中，共检测到5个亚型。ST3(共2份)中2份与MN526781(GenBank序列号)100%相似，且与3个人源ST3分离株位于同一进化支上。ST4(共9份)中4份与AY244621 100%相似，3份与MH127488 100%相似，2份与MH127500 100%相似，且与3个人源ST4分离株位于同一进化支上。ST5(共7份)中3份与MK937752 100%相似，3份与MF186709 100%相似，1份与MK937752达到99%以上的相似，但发生了个别碱基的突变，且与1个人源ST5分离株位于同一进化支上。ST10(共68份)中的40个样品的序列与MN526919 100%相似，14份与MK930358 100%相似，9份与MK937750 100%相似，1份与MN338085 100%相似，其余4份分别与MK937750(2份)、MN526919(1份)、MT042814(1份)达到99%以上的相似，但发生了个别碱基的突变。ST14(共8份)中5份与MN526815 100%相似，2份与MH807188 100%相似，1份与MF186707达到99%以上的相似，但发生了个别碱基的突变。

在本研究中共检测到5种亚型(ST3、ST4、ST5、ST10和ST14)，其中，ST10为优势亚型，占总阳性数的72.34%(68/94)，其次是ST4和ST14，分别占总阳性数的9.57%(9/94)和8.51%(8/94)。河南羊芽囊原虫检测到5种亚型(ST3、ST4、ST5、ST10和ST14)，是亚型种类最丰富的地区。在辽宁、青海、吉林、江苏、海南样品中分别检测到2种(ST10和ST14)、2种(ST5和ST10)、2种(ST5和ST10)、3种(ST4、ST10和ST14)、3种(ST4、ST5和ST10)基因亚型。

2.3 芽囊原虫ST3和ST4等位基因和MLST分析

经分析发现，2个ST3样品均为Allele 38，且在位点Locus 2和Locus 4发生了碱基突变。9个ST4 样品中有4个Allele 42，2个Allele 92，3个Allele 94。ST3的SSU rDNA位点序列与之前报道的序列(MN526781)完全匹配，但在多位点分析中发现2个位点出现了突变，在Locus 2位点与Allele 23相比有2个碱基的突变(A240G和C246T)，在Locus 4位点与Allele 41相比有个7个碱基的突变(分别是G61A、G235T、T260A、A338G、G396T、T422G和T460C)。但由于芽囊原虫MLST研究相关数据较少，暂无法进一步分析。

表2 不同品种羊芽囊原虫的感染情况和亚型分布

▲. 本研究的代表序列▲. The representative sequence of this study图1 基于SSU rDNA基因位点的芽囊原虫亚型系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of Blastocystis subtypes based on SSU rDNA gene locus

表3 ST3不同基因位点序列分析结果

3 讨 论

芽囊原虫是一种分布广泛的肠道原生生物，最近的基因组数据揭示了其潜在的毒力因子可能损害肠道屏障功能[15]。已经从鸟类、猪、牛、羊、野生食肉动物、非人灵长类、啮齿类动物、两栖动物、爬行动物和昆虫等体内检测或分离到芽囊原虫[16]。由于人类感染与各种哺乳动物和鸟类接触有关，芽囊原虫被认定为潜在的人畜共患病原[17]。已有报道显示，我国人与动物的芽囊原虫感染普遍[18]。本次研究中芽囊原虫总感染率为13.35%(94/704)，远低于2017年Song 等[19]报道陕西部分地区的58.05%(458/789)以及2020年谢世臣等[20]报道云南部分地区的41.35%(375/907)，高于2018年Li等[21]报道(安徽、江苏、山东和河南)的3.22%(52/1 613)以及2018年Wang等[11]报道黑龙江地区的4.92%(6/122)，与2019年郑玲[22]报道(河南、贵州、陕西、辽宁、内蒙古和新疆)的11.98%(112/935)感染率相当。目前，已有羊源芽囊原虫感染报道共涉及11个省区(安徽、贵州、河南、黑龙江、江苏、辽宁、内蒙古、山东、陕西、新疆和云南)，感染率前3的为陕西54.03%(463/857)，云南41.35%(375/907)，内蒙古39.13%(9/23)，但内蒙古的样本量较少。唯一没有芽囊原虫阳性的为新疆(共409份样品)。本调查中共涉及7个省份，其中，青海、吉林、海南和贵州的羊源芽囊原虫感染情况为首次报道。本次调查，来自贵阳的53份羊粪便样品中均未发现芽囊原虫。

本研究中在不同地区共检测到5种亚型(ST3、ST4、ST5、ST10和ST14)，其中，ST3、ST4和ST5为人兽共患亚型。ST10为感染羊的优势亚型，这与已知报道一致。从宿主的种属特异性分析，羊属于牛科动物，而牛科动物的优势亚型也为ST10，这也说明芽囊原虫属虽然具有广泛的宿主适应性，但在亚型水平上，也有明显的宿主特异性。本次调查首次在国内绵羊体内检测到ST3亚型。ST1～ST4是人类中普遍存在的亚型，这4个亚型占比超过90%[23]，尤其ST3，是人源芽囊原虫最常见亚型。

MLST是一种相对较新的序列差异分析方法，芽囊原虫的MLST研究有助于人们了解其表型和基因型之间的联系，等位基因的不同可能会解释芽囊原虫不同分离株的致病性差异。在已知报道中人类最常见的ST3等位基因型为ST3-Allele 34，其占比在70%以上[24]。有报道显示检测到一种与荨麻疹患者显著相关的等位基因(ST3-Allele 34)，因此，该等位基因可能具有一定的临床意义[25-26]。Pea等[27]报道在肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)患者中检测到ST4-Allele 42，这也是最常见的ST4等位基因。Melo等[28]报道在荨麻疹患者体内检测到ST1 (a4)、ST2 (a9和a12)、ST3 (a3、a36和a37)、ST4 (a42和a92)和ST6 (a122)。此外，Taghipour等[29]在结核患者中发现ST1-Allele 4。本研究为国内第一个羊芽囊原虫的MLST研究。本次调查所检测到的2个ST3样品均为Allele 38，9个ST4 样品中有4个Allele 42、2个Allele 92和3个Allele 94。基因型和临床症状之间的关系仍需要积累大量芽囊原虫的MLST数据才能作出科学的判断。Stensvold等[13]建立并应用ST3和ST4 MLST多位点分析方法发现，ST3的人类分离株仅限于发育进化树四个分支中的一个(除了与非人灵长类密切接触的饲养者等人群)，这表明ST3具有相对较高的宿主特异性，人ST3感染主要是由人传人引起的，而人类分离株落入其他分支极大概率是人畜共患传播的结果。本研究中ST4的MLST多位点扩增结果不理想，Ertug等[30]的报道中也提到过相同的问题，这可能与引物的扩增效率有关。本研究中发现的部分羊源人兽共患亚型可能存在同样的情况，饲养者与羊长期密切接触导致芽囊原虫跨越人畜的隔离而适应不同宿主。同时，有研究曾在处理过的废水中发现芽囊原虫，显示这种类型的灌溉水有向下游农田传播病原微生物的潜在作用[31]，这解释了饮用非自来水人群的高感染率，对该病原的预防提出了警示，而羊场的粪污对周围水源及环境的影响可能是潜在的风险因素。利用MLST对芽囊原虫进行分型将有助于人们更好地了解芽囊原虫的多样性，并评估MLST技术在临床中鉴别病原重要变异的潜力。

虽然芽囊原虫是导致腹泻的病原之一，但本次调查中羊粪便样本中腹泻样品占比极小，且腹泻羊和未腹泻羊在芽囊原虫检出率和基因型的分布上无显著差异。从目前已有的报道来看芽囊原虫分布广泛，但感染动物很少发病，提示芽囊原虫为一个机会致病性原虫，滕雪娇[32]等报道HIV-RNA病毒载量>50 copies·mL-1(χ2=9.561,P<0.05)是HIV携带者感染人芽囊原虫的危险因素。虽然与隐孢子虫、贾第虫相比，芽囊原虫致病性更弱，对动物的危害很小，但在人病例报道中，芽囊原虫与腹泻、腹痛、肠易激综合征、炎性肠病、荨麻疹等有一定的关联，所以其更重要的意义在于人兽共患风险。另一方面，芽囊原虫能改变宿主不同种肠道菌群的相对丰度，这对宿主间接产生何种影响还有待进一步探究。

本次调查共鉴定出芽囊原虫的5种亚型(ST3、ST4、ST5、ST10和ST14)，其中，人兽共患亚型3种(ST3、ST4和ST5)，提示了羊源芽囊原虫潜在的人兽共患传播风险，应引起人们的足够重视。本研究结果补充了羊源芽囊原虫流行资料和我国不同地区芽囊原虫感染分布的数据库，为芽囊原虫的进一步研究奠定了基础。

4 结 论

调查的7个省芽囊原虫总感染率为13.35%(94/704)，感染普遍，序列分析共发现5个亚型(ST3、ST4、ST5、ST10和ST14)，其中，ST3、ST4和ST5为人兽共患基因亚型，具有遗传多样性，应给予足够重视。