鸡蛋溶菌酶单克隆抗体的制备与鉴定

李 红,刘成倩,严华祥,孙凤萍,高 骏,姚惠娟,易建中

(上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106)

溶菌酶(Lysozyme)又称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、胞壁质酶,是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶[1],对革兰氏阳性菌的抗菌能力最强,也能抑制革兰氏阴性菌和真菌,还具有抗氧化能力。 溶菌酶作为一种生物体内的非特异性免疫因子,在抑杀病原体时不易产生抗药性,具有无毒、无害、无残留、抗菌谱广、活性稳定、安全性高等优良抗菌特性[2]。 溶菌酶不仅在生物体内有非特异性免疫功能,哺乳动物还可以通过乳汁将这种功能传递给幼崽,提高幼崽的抗病力;家禽通过蛋清传递给种蛋,提高胚胎发育的抵抗力。 溶菌酶在食品工业(防腐剂)[3-4]、医药(酶类抗菌药[5-6],抗病毒药[7-8])、饲料(替代抗生素[9-12])和生物工程(生物酶[13])等领域已经得到广泛运用,并有替代抗生素的趋势。

鸡蛋中的溶菌酶含量最高,占蛋清蛋白的3.5%,是提取溶菌酶的最佳来源[14-15]。 蛋清中的溶菌酶含量越高,酶活力越强,越有利于鸡蛋的储藏,因此测定鸡蛋蛋清中的溶菌酶对我国溶菌酶生产、禽蛋产品加工有重要的指导作用,其也是评定鸡蛋品质的重要参数之一。 目前,蛋清中溶菌酶的定量测定还没有一个较便捷的方法。 本研究通过制备溶菌酶抗体,旨在提供一种检测鸡蛋清中溶菌酶的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞系

SPF 级6—8 周龄雄性BALB∕c 小鼠购自复旦大学上海医学院;SP2∕0 细胞为本实验室保存。

1.2 主要试剂

弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、50 ×HAT、50 ×HT、PEG4000 鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(Mouse Monoclonal Antibody Isotype Reagent)和鸡蛋溶菌酶标准品均购自美国Sigma-Aldrich 公司;DMEM 培养基购自美国Hyclone 公司;胎牛血清购自美国GIBCO 公司;Protein G Resin 购自金斯瑞生物科技有限公司;增强型HRP-DAB 底物显色试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;HRP 标记羊抗鼠IgG、FITC 标记的羊抗鼠IgG 均购自美国Jackson 公司;其他常规试剂均为国产。

1.3 SDS-PAGE 检测溶菌酶

参照分子克隆实验指南,进行SDS-PAGE[16],其中分离胶和积层胶浓度分别为8%和5%。

1.4 动物免疫及血清抗体效价检测

选取3 只6—8 周龄健康BALB∕c 小鼠(编号为No.1—No.3),按每只小鼠100 μg 的剂量进行腹腔及背部皮下多点注射,免疫3 次。 首次免疫用弗氏完全佐剂,其余免疫用弗氏不完全佐剂。 免疫前和每次免疫后2 周尾静脉采血,检测抗体滴度。 融合前5 d 用相同剂量和方法对小鼠进行加强免疫。 溶菌酶蛋白以2 μg∕mL 的浓度包被酶标板,并用间接ELISA 方法检测血清抗体水平。

1.5 细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆化

细胞融合及亚克隆参考文献[17]。 无菌采集小鼠脾脏,将脾细胞按8∶1的比例与SP2∕0 细胞充分混合,用PEG4000(500 g∕L)进行融合。 按照脾细胞2 ×106个∕mL、100 μL∕孔计算,轻轻加入预温的HT 培养液。 24 h 后,每孔补加含有2 倍量A 的HAT 培养液,每孔100 μL。 4 d、7 d 和14 d 时分别半量换HAT 培养液、HT 培养液和普通DMEM 培养液。 每天观察细胞状态,标记融合细胞,待克隆细胞生长至孔底1∕4面积以上时,利用间接ELISA 法对上清液进行抗体效价检测,筛选阳性杂交瘤细胞,用有限稀释法筛选单克隆,并扩大培养、冻存,直到所有的克隆细胞孔都为阳性。

1.6 腹水制备及纯化

取18—22 周龄健壮的雌性BALB∕c 小鼠,每只小鼠腹腔注射500 μL 高压灭菌的石蜡油,5 d 后腹腔注射处于对数生长期的杂交瘤细胞1 ×106—2 ×106个∕只,5—7 d 后,选择腹腔明显膨胀,行动不便的小鼠,将注射器针头插入小鼠腹腔内取腹水。 4 ℃、12 000 r∕min 离心15 min,去除杂质。 逐滴加入饱和硫酸铵,慢慢搅拌2 h,4 ℃、12 000 r∕min 离心15 min,弃上清,沉淀用0.01 mol∕L 的PBS(pH 7.2)重悬。 利用Protein G Resin 纯化单克隆抗体,紫外吸收法测定浓度,SDS-PAGE 电泳分析其纯度。

1.7 MAb 效价测定

利用2 μg∕mL 鸡蛋溶菌酶包被酶标板,细胞培养上清和小鼠腹水做连续倍比稀释,用ELISA 方法测定上清和腹水中MAb 的效价。 阴性对照是SP2∕0 细胞上清及免疫前小鼠血清。 P∕N 不低于2.1 者视为阳性。

1.8 单抗亚型鉴定

选用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒,根据操作说明使用ELISA 方法鉴定单抗亚型。

1.9 MAb 特异性鉴定

1.9.1 ELISA 方法

鸡蛋溶菌酶和CD163 截短蛋白M-1(对照蛋白)以2 μg∕mL 浓度包被酶标板,SP2∕0 细胞培养上清为阴性对照,每孔100 μL,常规间接ELISA 方法检测该MAb 的抗原特异性。

1.9.2 Weston Blot 方法

8 μg 鸡蛋溶菌酶经SDS-PAGE 电泳分离,电转移至PVDF 膜上,4 ℃封闭过夜。 3E4 单克隆抗体作为一抗,HRP 标记羊抗鼠IgG 作为二抗,DAB 显色,Western Blot 鉴定该MAb 的抗原特异性。

2 结果与分析

2.1 小鼠血清抗体效价的检测

采集3 只小鼠三免后第14 天的血清。 将免疫前采集的血清(Pre)、三免后采集的血清分别稀释102倍、103倍、104倍和105倍,检测其抗鸡蛋溶菌酶抗体的效价。 由图1 可知,三次免疫后,小鼠血清抗体水平均达到1.0 ×105,加强免疫后可以进行细胞融合。

2.2 杂交瘤细胞株的建立及MAb 亚型鉴定

三次细胞融合的融合率分别为17.7%、19.4%和78.2%,经过筛选、克隆等,最后获得一株特异性和亲和力高,并能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,命名为3E4。 使用小鼠MAb 亚型鉴定试剂盒检测,经酶标仪读取450 nm 处吸光度值,判定3E4 抗体属于IgG2b 亚型(表1)。

图1 三免后小鼠血清抗体效价的ELISA 检测Fig.1 ELISA detection of mouse serum after 3rd immunization

表1 MAb 亚型鉴定Table 1 MAb subtype identification

2.3 MAb 的效价测定及分离纯化

收取单抗3E4 小鼠腹水16 mL。 细胞培养上清和腹水中抗体效价分别可达到2 560和1.0 ×106。 腹水经Protein G Resin 纯化,紫外分光光度计检测得3E4 的抗体浓度为1.8 mg∕mL。 SDS-PAGE 分析显示,纯化后MAb 主要有两条蛋白带:分子量约为50 ku 的重链带和25 ku 的轻链带。

2.4 3E4 单抗的特异性检测

由表2 可知,单克隆抗体3E4 与鸡蛋溶菌酶蛋白相互作用,与M-1 蛋白不相互作用,说明3E4 单抗具有较高抗原特异性。 Western Blot 结果显示3E4 与鸡蛋溶菌酶特异性结合(图2)。 综上,认为3E4 单克隆抗体具有高度的抗原特异性。

表2 单抗特异性的间接ELISA 方法检测(OD450 nm)Table 2 Detection of MAb specificity by iELISA(OD450 nm)

图2 Western blot 检测MAb 的抗原特异性Fig.2 Detection the specificity of MAb by Western blot

3 讨论与结论

溶菌酶在自然界中分布甚广,动物(鸟类、家禽的蛋清和哺乳动物的眼泪、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体液、组织细胞等),植物(卷心菜、萝卜、无花果)和微生物中处处可见[18]。 溶菌酶作为生物体内非特异性免疫的主要成员之一,具有与抗生素不同的抗菌机制和抑制病毒作用,其对人体无毒性,在体内无残留,是一种安全性非常高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。 在倡导绿色食品的今天,受到人们越来越多的关注和重视,具有相当广阔的应用前景[19]。 蛋清中溶菌酶含量越高,其酶活力越强,越利于鸡蛋的保存。 因此测定鸡蛋蛋清中溶菌酶对我国溶菌酶生产、禽蛋产品加工以及蛋品质评价具有重要的指导作用[20]。 琼脂板扩散法、比浊法和酶联免疫吸附(ELISA)方法是比较常用的溶菌酶检测方法。 琼脂板扩散法因测定时间长,操作复杂,灵敏度低,目前已少用[21]。 比浊法主要是检测溶菌酶的活性,而不是溶菌酶的净含量。 虽然可以根据所用标准品的活力进行转换,但是不同物种的溶菌酶分子量和活力不同,根据标准品的活力进行转换,其结果不够精准;同时,比浊法使用的微球菌悬液体是不均匀体系,测定结果重复性较差[22-23]。 ELISA 方法是利用免疫反应(即抗原—抗体反应)的高度特异性和酶促反应的高度敏感性,实现对抗原或抗体的检测,是一种定性和定量相结合的技术。 本研究是利用溶菌酶抗原与溶菌酶特异性抗体进行抗原抗体特异性反应,且反应颜色深浅和样本中溶菌酶浓度呈比例关系的原理来测定溶菌酶净含量。 ELISA 方法测定结果的变异系数较小,且易于实现批量检测,具有微量、特异、高效、经济、方便和安全等特点。 本试验获得了一株抗鸡蛋溶菌酶的高特异性单克隆抗体,为ELISA 检测方法的建立提供了关键的素材,为后期制备检测鸡蛋溶菌酶含量的ELISA 试剂盒奠定了基础。