EGFR以及nm23的蛋白表达在鼻咽癌预后及复发中的意义* *

苏 菁，肖 骋

(1.咸宁市中心医院/湖北科技学院附属第一医院耳鼻咽喉科，湖北 咸宁 437100；2.咸宁市中心医院/湖北科技学院附属第一医院神经内科)

鼻咽癌(NPC)是中国和东南亚部分省份头颈部最常见的恶性肿瘤之一[1-2]，原因尚不清楚，目前认为它与遗传、环境和病毒因素有关[3]。由于鼻咽部隐蔽的解剖位置，从而导致NPC早期症状不典型，大多数鼻咽癌患者在诊断明确时已经处于颈淋巴结转移的中晚期，最终治疗效果不佳。研究表明，局部复发和远处转移是绝大多数患者死亡的最终原因[4]，因此，找寻具有肿瘤特异性及与临床预后相关的分子标志物是提高肿瘤早期诊断准确率以及判断预后的关键，并且可能成为新的治疗靶标[5-6]。目前，关于鼻咽癌复发和转移相关分子标志物的研究很少，寻找NPC复发和转移相关的分子标志物对预测鼻咽癌患者预后和复发具有重要临床意义。内皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是酪氨酸蛋白激酶受体之一，它是由c-erbB致癌基因编码的一组受体[7]，EGFR信号通路已被证明在多种肿瘤的发生和发展中起重要作用[8]；nm23是第一个在转移性癌细胞中低表达的细胞，其表达与各种恶性肿瘤中的肿瘤转移潜能呈负相关[9-10]。EGFR及nm23这两种受体在NPC中的表达及与NPC临床分期和淋巴结转移，以及远处转移的关系有着不同的结论。本研究采用免疫组织化学方法检测鼻咽癌组织中EGFR和nm23的表达，探讨其与鼻咽癌发生、发展的关系，并进一步分析两者是否可作为评估鼻咽癌侵袭、浸润和转移潜能及预后的有效参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾2004年1月至2012年1月本科收治确诊为鼻咽癌患者(无抗癌治疗)为观察组；所有纳入患者均保留原始的病理组织蜡块并且有完整的随访记录。该标准内病例共纳入55例患者，其中男40例，女15例；平均年龄(43.7±1.6)岁；NPC分期采用1992年福州TNM分期法，其中Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ～Ⅳ期33例；颈淋巴结转移40例，其中N1期18例，N2期15例，N3期7例；无淋巴结转移15例。Ⅰ、Ⅱ期行放疗，放疗量:NPDT 6800～7200CGy；除了Ⅲ期和Ⅳ期的放疗外，还合并了顺铂(DDP)和氟尿嘧啶(5-FU)联合化疗。对照组20例鼻咽黏膜标本病理报告诊断为鼻咽黏膜慢性炎症，其中男15例，女5例；平均年龄(42.3±2.1)岁。

1.2 检测方法

所有组织标本常规石蜡包埋后切片，予以苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色核实病理学诊断。运用二步法免疫组织化学法检测切片组织中EGFR、nm23的表达。鼠抗人EGFR单克隆抗体及nm23单克隆抗体，免疫组织化学SP试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色剂均由武汉三鹰生物技术有限公司提供。抗原修复方法采用微波修复90s，使用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，采用已知鼻咽癌阳性组织切片作为阳性对照。

1.3 结果评定

分别切取5张不同层面的组织蜡块切片进行染色，每张切片在镜下(200倍)随机选取5个不同视野进行分析。指标EGFR表达采用不透光平均值分析(尼康SP4200分析软件)，根据观察范围内不透光平均值将表达强度分为0～3度不同等级，其中0代表阴性(-)；1代表弱阳性(+)；2代表中度阳性(++)；3则为强阳性(+++)。nm23则采用阳性细胞数人工统计进行判定，由3名实验员分别阅片，统计视野中阳性细胞数的表达比例，将阳性率分为0～4个等级，分别为0级：≤5%；1级：6%～25%；2级：26%～50%；3级：51%～75%；4级:≥76%，0～4级分别对应阴性(-)、弱阳性(+)、中度阳性(++)、强阳性(+++)、强强阳性(++++)。

1.4 统计学方法

所有数据均采用SPSS 14．0统计学软件进行统计分析，分别行χ2检验及Pearson列联系数分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组鼻咽黏膜组织中EGFR、nm23蛋白表达比较

在对照组及观察组的鼻咽黏膜组织中EGFR的阳性表达率分别为5.45%(3/55)及76.36%(42/55)(P<0.01)，而nm23在对照组以及观察组的鼻咽黏膜组织中阳性表达率分别为74.54%(41/55)及32.72%(18/55)(P<0.01)，提示EGFR在观察组的鼻咽黏膜组织中表达明显较高，而nm23则在对照组的鼻咽黏膜组织中表达较高，均具有较好的特异性。具体见图1(封三)。

2.2 鼻咽癌患者鼻咽黏膜组织中EGFR、nm23表达与临床特征及预后的关系

如表1所示，鼻咽癌患者的鼻咽黏膜中EGFR的表达水平与临床分期呈正相关，Ⅲ、Ⅳ期患者癌组织中EGFR表达高于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05)，与肿瘤的远处转移率呈正相关(P<0.05)，与5年生存期呈负相关(P<0.05)，但其表达与性别、年龄、淋巴转移、T分期、N分期以及原位复发率无明显相关性。而鼻咽癌患者的鼻咽黏膜中nm23的表达水平与临床分期(P<0.05)、N分期(P<0.05)、远处转移(P<0.05)均呈负相关。nm23的表达水平与5年生存率呈正相关(P<0.05)。但nm23表达与性别、年龄、T分期以及原位复发率均无明显相关性。

表1 EGFR及nm23表达与鼻咽癌临床特征及预后的关系

2.3 鼻咽癌组织中EGFR、nm23蛋白表达与鼻咽癌患者生存时间的分析

我们采用乘积极限法对55例患者的生存时间进行单因素的生存分析，并制作生存曲线。结果发现(图2)EGFR蛋白表达(+～+++)组的中位生存时间为44.5个月，而EGFR蛋白表达(-)组的中位生存时间为65个月，2组间差异具有统计学意义(P<0.05)；nm23蛋白表达(+)组的中位生存时间为88个月，nm23蛋白表达(-)组的中位生存时间为44个月，两组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。

A：EGFR(+～+++)对比EGFR(-)；B：nm23(+～+++)对比(-)

3 讨 论

由于NPC解剖结构复杂以及对放射线敏感，使得放射性疗法成为目前所有无远处转移NPC首选的治疗方案，即使是在疾病的晚期，单独使用放疗仍可达到高于70%的控制率，且5年生存率可达到50%[11]。对晚期病例，联合放化疗是目前公认最为规范的治疗方式[12-13]，研究表明在晚期患者中，放化疗结合可提高5年生存率[14]。虽然，随着治疗方式的不断进展，NPC的5年生存率逐渐提高，但这当中依然有25%～30%的患者最终会发生肿瘤的原位复发或远处转移，这仍然是NPC治疗中最具有挑战性的问题[15-16]。在当前的治疗水平下，寻找早期的预警生物标志物成为提高治疗效果的最佳选择。

EGFR可与多种配体结合并通过激活下游的通路调控多种生物学过程[17]。研究提示EGFR信号通路的改变在肿瘤血管生成、增殖浸润以及细胞凋亡的过程中发挥了至关重要的作用[18]。已有研究证实，EGFR的表达水平与头颈部鳞癌的关系密切，EGFR较高的表达水平则预示着较低的生存率[19]。但NPC在病因学、流行病学、临床过程、预后结局以及治疗选择等方面与头颈部鳞癌以及其他肿瘤均有所不同，其具有局部易复发以及好远处转移的特点。因此，本研究着重观察了NPC的临床特点和EGFR表达两者之间的关系。研究结果显示，在NPC患者中EGFR的阳性表达率是明显较高的，提示EGFR与NPC的发生关系密切，可作为区分良恶性的参考指标。进一步通过对其与NPC临床特征的关系分析，发现在有远处转移的患者中EGFR的表达率较无远处转移者高。因为EGFR调控血管的生长以及细胞移行等多种生物学过程，EGFR参与肿瘤的远处转移并不让人惊讶。同时我们还发现在临床分期Ⅲ-Ⅳ患者较Ⅰ-Ⅱ期患者组织中EGFR表达率明显升高，及5年以上生存率患者较5年以下生存率患者EGFR表达明显较低。上述结果表明，EGFR蛋白的高表达表明肿瘤是侵袭性非常强大的，因此，远处转移的可能性也很大，其5年生存率相对较低。

nm23基因被认为是抑制肿瘤远处转移及其转移潜能的最重要基因之一。研究证实，nm23低表达或者突变与一系列组织中恶行肿瘤的不良预后有密切关系，如乳腺、胃肠、肝脏以及黑色素瘤等[20]。但目前为止，nm23表达与NPC的预后之间的关系报道甚少。在本研究中发现，与EGFR类似的nm23表达与NPC患者的临床分期、远处转移以及5年生存率密切相关，这可能与nm23的编码产物二磷酸核苷激酶(NDPK)有关。NDPK调节G蛋白介导的细胞信号传导，影响微管组装，维持正常细胞分裂，从而抑制癌细胞转移[21]。我们同样认为，nm23的低表达提示鼻咽癌出现远处转移的风险较高，预示预后较差，同时nm23表达还与5年生存率密切相关。nm23的高表达提示鼻咽癌的预后较好，生存时间较长。

肿瘤的侵袭与转移由多种因素影响，比如试验样本选择、评分标准等，而且它是一个多基因、多步骤的复杂过程，因此，EGFR与nm23之间的关联性还需要我们进一步的研究。这个实验表明，NPC的生物学行为与EGFR、nm23的异常表达有着非常密切的关系，EGFR的高表达和nm23的低表达反映出鼻咽肿瘤的生物学行为更危险，恶性程度高，患者预后相对较差。因此，我们推测EGFR、nm23可作为判断鼻咽癌恶性程度和预后的有价值指标。