食药用菌茯苓对藤茶的生物转化效应

冯彦勇，陈雪梅，匡凤军，郭 焘，杨玉娟，周 强， 汤 丹，龙玉平

（1. 湖南口味王集团有限责任公司，湖南 益阳 413001；2. 湖南中益食品化工检测院，湖南 益阳 413001）

藤茶系葡萄科蛇葡萄属的一种野生藤本植物，因其性凉、味甘淡，有消暑止渴、去癖消肿、止血止痛、消炎解毒、通经络等保健功效以及治疗感冒发热、口腔溃疡、南喉奚徒、肝炎等药用价值，作为药食同源的中药材使用已有一千多年的历史。但关于藤茶的系统研究仅有二三十年的历史，国内外学者对该属的8个品种进行化学成分研究发现其主要含有黄酮、鞣质、低聚芪、蒽醌、甾体、萜类等成分，其中黄酮类成分是藤茶中最主要的活性物质，包括二氢杨梅素、杨梅素、藤茶素和藤茶苷等[1-6]。食药用担子菌包括野生的冬虫夏草、蝉花等以及人工栽培的灵芝、茯苓、猪苓等。这些食药用担子菌的共同点就是无明显毒副作用。近代医学研究表明，它们不仅具有传统的益气、强身、祛病、通经、益寿等功能，还具有很好的药用保健价值[7-12]。

长期以来，藤茶加工主要产品为冲泡型的藤茶。在加工过程中因工艺的不同藤茶产品质量不一，但不管使用哪种加工工艺，藤茶固有的涩味均难以去除，导致藤茶的推广应用受到限制。

基于藤茶的活性成分以及食药用真菌的转化作用，采用食药用菌茯苓对藤茶进行生物转化，分析发酵前后藤茶主要活性物质及特征香气成分的变化，以期为藤茶资源的开发利用开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试样品为来凤藤茶，市场购买；主要试验试剂有甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）、甲酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（Sigma-Aldrich 公司）、二氯甲烷（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；主要仪器设备有LC-20A 高效液相色谱仪（日本岛津公司）、7890A/5975C 气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）、SHZ-D 型旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）、FZ102 型粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）、FA2004 型电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 茯苓藤茶发酵工艺 取实验室保藏的茯苓菌种，在土豆琼脂斜面上活化，于25℃培养7 d 后接种到土豆液体培养基，至于恒温摇床（150 r/min，25℃）培养7 d 后得到液体菌种。分别称取一定量的藤茶于250 mL 的三角瓶中，按1 ∶20 的固液比加入水，封口后121℃灭菌20 min，冷却后接入茯苓液体菌种，在25℃条件下发酵，并分别在发酵0、6、9、12、15 d 取样进行后续分析。

1.2.2 样品中活性成分及DPPH 自由基清除能力的测定 茶多酚含量依据GB/T 8313—2008 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法测定，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[13]，根据李晓芬[14]的方法测定样品的DPPH 自由基清除能力。

1.2.3 藤茶黄酮类物质样品制备 藤茶样品粉碎后过80 目筛，用80%乙醇以1 ∶20 的料液比回流提取1 h，离心过滤后定容到一定的体积，用0.22 μm 微孔滤膜过滤即得。

1.2.4 高效液相色谱分析黄酮类物质条件 色谱柱为Hypersil C-18 反相柱（100 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A 为甲醇、流动相B 为0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0～17 min（5%～20% B）、17～47 min（20%～40% B）、47～62 min（40%～60% B）、62～80 min（60%～80% B）、80～85 min（80%～5% B）、85～95 min（5%～5% B）；进样量10 μL；流速1.0 mL/min；柱温室温；检测波长292 nm。

1.2.5 藤茶香气精油的制备 取样品80 g，置于5 L

圆底烧瓶中，加入1 L 蒸馏水，用40 mL 的二氯甲烷在同时蒸馏萃取（SDE）装置中提取5 h，二氯甲烷提取液用旋转蒸发仪浓缩至2 mL，再用无水硫酸钠除水得到藤茶香气精油[15]。

1.2.6 气相色谱-质谱分析香气精油条件 GC 条件 ：Agilent 7890A/5975C 气质联用仪，色谱柱为HP-5 毛细管柱（30 m × 250 μm × 0.25 μm），进样口温度为220℃，检测器温度为200℃，分流比为20 ∶1，检测器为FID。程序升温条件：初始温度50℃，保持2 min，5℃/min 升至190℃，之后以10℃/min 升至250℃保持4 min。MS 条件：接口温度为190℃，离子源温度230℃，电离方式为EI，扫描范围（m/z）为20～500 amu。检索谱库为NIST05。

2 结果与分析

2.1 黄酮类物质含量的变化

黄酮类物质具有抗氧化、抗肿瘤、清除自由基等功效，茶叶中的黄酮类物质对其感官品质影响显著[16]。对来凤藤茶主要黄酮类物质（二氢杨梅素和杨梅素）含量在食药用菌茯苓发酵前后的变化进行了分析，结果如图1 所示，二氢杨梅素和杨梅素的含量在生物转化前后没有发生明显变化。这表明采用食药用菌茯苓对藤茶进行生物转化不会对藤茶的主要黄酮类活性物质造成破坏。

2.2 发酵时间对样品中活性成分及DPPH 自由基清除能力的影响

2.2.1 茶多酚 茶多酚是存在于茶叶中的一类多元酚混合物，是茶叶中主要的活性物质之一，在茶汤中呈苦涩味，其含量是衡量茶叶品质的重要指标之一[17]。如图2 所示，在食药用菌茯苓发酵藤茶的过程中，茶多酚含量随着发酵时间的增加呈上升趋势，发酵至第12 d，茶多酚含量达到最高（14.62 μg/mL），比初始含量增加了5.04%，进一步延长发酵时间，茶多酚含量呈下降趋势，茶多酚含量在发酵第15 d 下降至14.18 μg/mL。在藤茶的整个生物转化过程中，茶多酚含量变化幅度在5%以内，表明利用食药用菌茯苓发酵藤茶对茶多酚含量产生的影响很小。

2.2.2 多 糖 多糖具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、调节细胞分裂分化、降血脂和增强免疫力等，是藤茶具有保健药用功效的主要活性物质之一[18]。由图3 可知，食药用菌茯苓对藤茶进行生物转化的整个过程中，多糖的含量一直处于不断增加的趋势，发酵至第15 d 时，多糖含量由初始的10.25 μg/mL 增至37.63 μg/mL，增幅达218%。由于食药用菌茯苓亦可合成多糖，因此，初步推测生物转化过程中多糖的大幅增加是由茯苓菌发酵引起的。

2.2.3 DPPH 自由基清除能力 抗氧化作用是藤茶保健药用功效之一。食药用菌茯苓对藤茶进行发酵的过程中，藤茶粗提物清除DPPH 自由基的能力随发酵时间的延长呈大幅增长趋势（图4），增长幅度高达246%，且与多糖含量的变化呈现出一定的相关性。这可能是因为在发酵过程中，茯苓产生了大量的抗氧化活性物质（如多糖类），使藤茶的DPPH 自由基清除能力大幅提升。

2.3 藤茶香气成分的变化

藤茶的香气精油经GC-MS 分析和谱库NIST05检索匹配，共定性27 种化合物（图5，图6）。如表1 所示，其中主要成分为糠醛、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯、2-甲基戊酸甲酯等香气成分及棕榈酸、亚油酸、亚麻酸等酸类物质。藤茶在发酵过程中β-紫罗兰酮等特征香气成分并未消失，只是相对百分含量有所改变。藤茶经茯苓发酵产生了浓郁的水果香味，其主要成分为酯类，发酵9 d 时其相对含量达到22.74%（图7）。随着藤茶发酵时间的延长，酸类物质的含量大幅增加，其总含量从发酵初的12.92%上升到发酵15 d 的46.59%（图8），这将对藤茶的口感产生一定影响。

图1 发酵过程中黄酮类物质含量变化

图2 茶多酚含量的变化

图3 多糖含量的变化

图4 DPPH 自由基清除能力变化

3 结论与讨论

茯苓对藤茶的生物转化比较温和，能较好地保留藤茶原有的形态和主要的活性物质，同时在发酵过程中积累了大量的茯苓多糖等活性代谢产物，由于茯苓多糖等活性物质具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒及增强免疫功能的作用[18-20]，故通过茯苓发酵，藤茶的保健功效将得到很大提升。

表1 发酵过程中藤茶主要香气成分相对含量变化

图5 藤茶原料香气成分GC-MS 总离子流

图6 发酵藤茶香气成分GC-MS 总离子流图

图7 2-甲基戊酸甲酯含量变化

图8 酸类物质含量变化

在藤茶发酵过程中，保留了藤茶的特征性香气成分，并产生新的香气成分2-甲基戊酸甲酯，使藤茶带有浓郁的水果香味，藤茶原有的苦涩味得到改善；随着发酵时间的延长，酸类物质的总含量大幅增加，总酸含量的升高将对藤茶的口感产生一定影响，但总酸含量可通过调节发酵时间、水分含量等发酵参数得到一定程度的控制。