胆碱和甜菜碱型甲基营养素对大鼠同型半胱氨酸水平的影响

章 文，郝贝贝，潘四豪，杨佳可，于沙沙，赵志娜，尚校军，史永利，阎玺庆

(1.新乡医学院药学院，河南 新乡 453003；2.河南省第二人民医院药学部，河南 郑州 451191；3.河南兴龙生物技术有限公司，河南 新乡 453000)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是蛋氨酸在人体代谢过程中的正常代谢产物，高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinaemia，HHcy)是一种以血液中Hcy升高为特征的疾病，中国高血压防治指南(2018年修订版)将Hcy≥15 μmol·L-1列为引起心血管疾病的危险因素之一[1]。流行病学调查和临床病例研究已证实，HHcy在动脉粥样硬化和血栓栓塞性疾病如脑卒中、冠状动脉性心脏病及静脉血栓性疾病等的发病机制中起着重要的作用，是这些疾病的独立危险因素之一[2]；HHcy还与阿尔兹海默病、骨质疏松、糖尿病等疾病相关[3]；血液中过高的Hcy水平还会引起生长发育迟缓和大脑智力发育障碍[4-5]。因此，降低体内Hcy水平，是预防这些疾病的关键因素。

Hcy在细胞内的代谢主要分为叶酸依赖的甲基化途径、非叶酸依赖的甲基化途径和转硫途径[6]。甲基化途径是Hcy最重要的转化方式，所需甲基可以通过食物中营养物质获得，但正常食物营养中所含甲基无法将患者Hcy降低到正常水平，因此，在食物中添加含有甲基的营养成分对HHcy的预防和治疗至关重要。一些维生素类营养成分如叶酸、维生素B6、维生素B12、胆碱、甜菜碱等均含有降低Hcy所需的甲基，可直接参与能使体内Hcy降低的蛋氨酸循环，通常将这些能够提供甲基化反应所需的膳食补充成分称为甲基营养素[7]。高剂量蛋氨酸饮食喂养是建立HHcy模型的方法之一[8]。本研究通过高蛋氨酸饮食喂养建立HHcy大鼠模型，探讨以胆碱和甜菜碱为主要成分的甲基营养素对HHcy的预防和治疗作用，为胆碱和甜菜碱型甲基营养素的研发提供理论和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康4～5月龄清洁级雄性Sprague Dawley大鼠80只，体质量200～300 g，购自河南省实验动物中心[SCXK(豫)2015-0004]，分笼饲养，自由饮水，适应性喂养2 d后分组。

1.2 药物、试剂与仪器灭菌大鼠饲料购自新乡市奥美隆科贸易有限公司，蛋氨酸、胆碱、甜菜碱购自美国唐瑞斯食品物料公司，叶酸、维生素B6、维生素B12购自美国Sigma公司，大鼠Hcy酶联免疫吸附试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司，灭菌去离子水由本实验室制备；Spectra Max i3型多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司，ThermoFisher-MultifugeX1R低温高速离心机购自美国赛默飞公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物饲养与分组大鼠适应性喂养2 d后随机分为对照组、模型组、预防组1、预防组2、预防组3、预防组4、治疗组1、治疗组2、治疗组3、治疗组4，每组8只。对照组大鼠正常饲料喂养，模型组大鼠给予含质量分数2%蛋氨酸饲料喂养制备HHcy模型，预防组1大鼠给予含质量分数2%蛋氨酸和叶酸的饲料喂养，预防组2大鼠给予含质量分数2%蛋氨酸、叶酸、维生素B6、维生素B12的饲料喂养，预防组3大鼠给予含质量分数2%蛋氨酸、叶酸、维生素B6、维生素B12、胆碱的饲料喂养，预防组4大鼠给予含质量分数2%蛋氨酸、叶酸、维生素B6、维生素B12、甜菜碱的饲料喂养，共喂养45 d。治疗组1、治疗组2、治疗组3、治疗组4大鼠前30 d给予含质量分数2%蛋氨酸的饲料喂养，之后分别添加与预防组1～4相对应的营养素喂养45 d。各组大鼠给予叶酸、维生素B6、维生素B12、胆碱、甜菜碱的剂量分别为0.037 5 mg·kg-1、0.833 0 mg·kg-1、0.520 8 μg·kg-1、52.083 0 mg·kg-1、52.083 0 mg·kg-1。

1.3.2 各组大鼠血清中Hcy水平的检测对照组、模型组、预防组大鼠于第45天，治疗组大鼠于第75天给予30 g·L-1水合氯醛麻醉，心脏针刺取血约4 mL，3 000 r·min-1离心15 min，取上清液，采用大鼠Hcy酶联免疫吸附试验试剂盒进行检测，按照说明书步骤进行操作。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值，通过标准曲线计算样品中Hcy水平。

2 结果

各组大鼠血清中Hcy水平见表1。模型组大鼠血清中Hcy水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。预防组1、预防组2、预防组3、预防组4大鼠血清中Hcy水平均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；预防组2、预防组3、预防组4大鼠血清中Hcy水平均低于预防组1，差异有统计学意义(P<0.05)；预防组2、预防组3、预防组4大鼠血清中Hcy水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)；预防组3、预防组4大鼠血清中Hcy水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

治疗组4大鼠血清中Hcy水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05),其余各治疗组大鼠血清中Hcy水平与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠血清Hcy水平比较

3 讨论

Hcy主要通过4条途径进行代谢：(1)Hcy在蛋氨酸合成酶的作用下，以维生素B12为辅因子，以N5-甲基四氢叶酸为甲基供体，甲基化生成蛋氨酸。这一过程可在所有体细胞中进行。以维生素B2为辅酶的亚甲基四氢叶酸还原酶催化N5，N10-亚甲基四氢叶酸形成N5-甲基四氢叶酸参与Hcy再甲基化。(2)以甜菜碱为甲基供体，在甜菜碱-高半胱氨酸甲基转移酶参与下，再次甲基化生成蛋氨酸及二甲基甘氨酸。这一过程在肝脏和肾脏细胞内进行。(3)Hcy与丝氨酸在β-胱硫醚合成酶催化下，以维生素B6为辅因子，生成胱硫醚。(4)Hcy直接释放到细胞外液。其中前2种途径再甲基化生成蛋氨酸，构成蛋氨酸循环。Hcy代谢通路的任一环节发生异常，即可能导致Hey转化受阻而在体内积蓄，最终形成HHcy。因此，可以通过补充甲基供体来降低Hcy水平。

由于叶酸[9]、维生素B12和维生素B6等可提供甲基[10]，降低体内同型半胱氨酸含量，因此对防治HHcy及其诱发的心脑血管疾病有一定效果[11-12]。胆碱、甜菜碱作为甲基供体，广泛应用于食品和饲料的添加剂。很少有将叶酸、维生素B6、维生素B12和甜菜碱进行配方研究，关于含胆碱配方对Hcy水平影响研究更少。HHcy动物模型的建立可以通过喂养一定量蛋氨酸实现，不同蛋氨酸含量的饲料诱导大鼠HHcy的效果不同[13]。研究证明，喂养含质量分数2%蛋氨酸的饲料建立HHcy模型方法简单可行。因此，本研究通过给大鼠喂养含质量分数2%蛋氨酸饲料制备Hhcy模型，并考察了叶酸+维生素B6+维生素B12+胆碱和叶酸+维生素B6+维生素B12+甜菜碱2种配方用于防治HHcy的效果，结果显示，各预防组大鼠血清中Hcy均低于模型组，差异有统计学意义，说明这几种配方均能显著降低血液中Hcy水平；添加胆碱或甜菜碱的预防组大鼠血清中Hcy水平略低于未添加二者的预防组，但差异无统计学意义。另外，本研究还显示，治疗组4大鼠血清中Hcy水平显著低于模型组，其余各治疗组与模型组大鼠血清中Hcy水平比较差异均无统计学意义，且治疗组4与其他治疗组大鼠血清中Hcy水平比较差异无统计学意义，说明甜菜碱的添加可能对HHcy有治疗作用。

综上所述，以胆碱和甜菜碱为主要成分的甲基营养素对HHcy均有一定的预防作用，以甜菜碱为主要成分的甲基营养素可以降低Hcy水平，但以胆碱为主要成分的甲基营养素未发现可降低Hcy水平，因此，以胆碱和甜菜碱为主要成分的甲基营养素能否用于治疗HHcy尚需进一步研究进行验证。