过氧化氢诱导心肌细胞凋亡的实验研究

曾兰芬，张新敏，肖 雪，孙国亮，李浩波，张良清

（1 广东医科大学附属医院麻醉科 广东 湛江 524000）

（2 吉林大学第一医院麻醉科 吉林 长春 130000）

（3 中山大学附属第三医院麻醉科 广东 广州 510000）

心肌缺血及再灌注后心肌细胞自身或浸润的炎性细胞释放大量活性氧（ROS），致大量心肌细胞死亡[1-2]。本文以H9C2 心肌细胞为研究对象，旨在探索H2O2诱导心肌细胞凋亡的浓度及处理时间。

1.资料与方法

1.1 实验材料

H9C2 心肌细胞株购自上海中国科学院细胞库；H2O2溶液购自ATT Bioquest 公司；CCK-8、活性氧及细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天公司；所用抗体购自CST 公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自thermo fisher 公司；乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；高糖DMEM 基础培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Gibco 公司；PBS、双抗（青/链霉素）购自北京索莱宝科技有限公司。倒置显微镜购自德国徕卡公司；离心机购自德国艾本德公司；流式细胞仪购自美国BD 公司；酶标测试仪购自德国Berthoid 公司；全自动化学发光图像分析系统购自上海天能公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏及培养

从-80℃冰箱取出冻存的细胞，放于37℃水浴锅内使其迅速融化，加入等量完全培养基，离心，弃上清，用完全培养基重悬细胞，按合适密度铺板，置于37℃的5% CO2培养箱中培养，当细胞汇合度达90%及以上时，予传代处理。

1.2.2 氧化应激模型建立

将H9C2 细胞接种于96 孔板，待贴壁后，进行后续处理。按H2O2浓度梯度将实验分为6 组：对照组、50μm H2O2组、100μm H2O2组、200μm H2O2组、300μm H2O2组及400μm H2O2组，各组加入不同H2O2浓度处理6 h，检测细胞活力及LDH 水平，确定合适的H2O2浓度。按H2O2处理时间梯度将实验分为6 组，对照组、2 h 组、4 h 组、6 h 组、12 h 组及24 h 组，加入相同浓度H2O2，于不同时间点检测细胞活力及LDH水平，确定H2O2合适的处理时间。

1.2.3 细胞活力检测

将H9C2 心肌细胞接种于96 孔板，细胞贴壁后，予相应处理后，加CCK8 试剂10μl，37℃孵育2 h，酶标仪检测各组细胞相关的吸光度。

1.2.4 细胞上清LDH、MDA 及SOD 水平检测

收集各组细胞上清，按照试剂盒说明书进行实验操作，酶标仪检测各组细胞上清OD 值，按公式计算出对应数值。

1.2.5 细胞活性氧（ROS）水平检测

按照活性氧检测试剂盒说明书进行操作，孵育完成后，用无血清培养基洗涤细胞3 次，荧光显微镜下计数单视野下阳性细胞。

1.2.6 蛋白表达水平检测

按分组处理细胞，收集细胞沉淀，RAPI 裂解液冰上裂解细胞30 min，4℃下12 000 r/min 离心15 min，取上清，BCA 法定量，SDS-PAGE 胶电泳，湿转法转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，孵一抗，4 ℃过夜，TBST 洗膜3 次，10 min/次，孵二抗，室温1 h，TBST 洗膜3 次，10 min/次。ECL 法曝光检测。

1.2.7 细胞凋亡流式细胞术检测

收集细胞到1.5 mL 离心管中，加入100 μl Binding Buffer，吹打重悬细胞，避光加入5 μl FITC-Annexin V和5 μl PI，混匀后室温（避光）孵育30 min，上机检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计软件分析相关数据。计量资料采用均数±标准差（± s）表示，行t 检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 氧化应激模型建立

H2O2浓度梯度实验：与对照组比，50μm H2O2组及100μm H2O2组细胞活力及LDH 水平差异无统计学意义（P均＞0.05）；200μm H2O2组、300μm H2O2组及400μm H2O2组细胞活力降低、LDH 水平升高，差异有统计学意义（P 均＜0.05）。选取浓度为200μm H2O2进行后续实验。H2O2处理时间梯度实验：与对照组比，2 h 组及4 h 组细胞活力及LDH 水平差异无统计学意义（P 均＞0.05）；6 h 组、12 h 组及24 h 组细胞活力降低、LDH 水平升高，差异有统计学意义（P 均＜0.05）。其中12 h 组心肌细胞活力约为63%，适合进行后续实验，所以选择200μm H2O2处理细胞12 h作为建立H9C2心肌细胞氧化应激模型的条件。见表1。

表1 各组细胞活力及LDH 水平检测（OD 值）

2.2 两组氧化应激水平比较

H2O2组心肌细胞ROS 阳性细胞比例、MDA 水平均高于对照组，SOD 水平明显下降，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

表2 两组ROS、MDA 及SOD 水平比较（OD 值）

2.3 细胞凋亡情况比较

H2O2组Bax、Cleaved/caspase-3 以及凋亡率均高于对照组，Bcl-2 低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表3。

表3 两组细胞凋亡相关指标检测

3.讨论

氧化应激损伤致心肌细胞凋亡在心肌缺血及再灌注中起重要作用，诱导氧化应激致心肌细胞凋亡模型的成功建立可为心肌梗死的临床治疗及药物开发提供实验基础，具重大意义。而H2O2在各种活性氧（ROS）生产者中起核心作用[3]，用H2O2诱导心肌细胞氧化应激损伤是正确选择。但目前用H2O2诱导心肌细胞凋亡的处理条件相差甚大[4-5]。本研究旨在探究H2O2诱导H9C2 心肌细胞凋亡合适的浓度及处理时间，结论是200μm H2O2处理H9C2 心肌细胞12h可明显导致心肌细胞凋亡。实验过程发现H2O2性质很不稳定，建议分装长期存于-20℃，短期避光存于4℃。另外，H2O2品牌、细胞状态以及操作因素等也会影响H2O2用量及处理时间。建议购买浓度精确的H2O2，保证实验细胞处于良好生长状态，以及保证实验操作的一致性。

综上所述，本研究成功探索出H2O2诱导H9C2 心肌细胞凋亡的方法，并发现其中存在的问题及提出建议。将对后期H2O2诱导心肌细胞凋亡模型构建具有重要的指导意义。