不同类型土壤中CP4-EPSPS基因的降解规律及对环境影响的研究

王 康

(广东农工商职业技术学院 热带农林学院 作物生产技术系，广东 广州 510000)

为此，本实验以转CP4-EPSPS基因抗除草剂玉米CC-2为试材，通过室内掩埋试验，建立不同环境下该蛋白在土壤中的降解模型，明确其降解时间，进而解析转CP4-EPSPS基因玉米CC-2中外源表达蛋白CP4-EPSPS在土壤中的降解规律，为今后转CP4-EPSPS基因抗除草剂玉米CC-2商业化做监控数据积累，为其后续释放田间、进行大面积种植的环境安全监测提供理论依据。

1 文献回顾

1.1 主要转基因作物的研究进展

随着现代化农牧业逐渐向产业化方向发展，转基因技术已然成为了国内外研究的热点之一，转基因技术在不同作物中的应用领域主要涉及4个方面：(1)基于抗虫改良方面的研究：以抗棉铃虫、抗作物根部线虫等方面的研究为主；(2)基于抗除草剂改良方面的研究：主要应用在抗草甘膦、抗草铵膦等方面的品种开发；(3)给予耐逆性改良方面的研究：主要针对在干旱环境、盐碱环境等条件下的改良研究；(4)基于综合性状提升的品质改良，是目前转基因育种的新兴领域，侧重于某些特殊要求的转基因应用研究：主要应用在生产特殊蛋白、特定的需求成分等方面。

1.2 转基因抗除草剂作物环境安全评价研究进展

自1996年转基因作物在美国商业化种植，其在全球的种植面积一直呈现持续、快速增长的趋势。所种植的转基因作物主要是抗除草剂和抗虫作物，其中抗除草剂作物占种植总面积较大。抗除草剂作物的种植为杂草的高效控制提供了新的手段，但其可能带来的生态环境风险也引起了世界各国的广泛关注和争议。从转基因作物的研制开始,其安全性问题一直受到各国政府、专家及公众的广泛关注。在转基因作物大规模商业化种植前对其进行系统、严格的安全性评价，并在释放后进行跟踪监测是目前各国对转基因作物风险管理的共识。我国政府对转基因作物的商业化利用持积极而谨慎的态度，既充分肯定转基因技术对农业生产力的巨大推动作用，积极支持和推进转基因生物的研发利用，也充分考虑转基因作物的种植对生态环境及人类健康可能带来的潜在风险,高度重视转基因作物的安全性评价。

对于转基因抗除草剂作物的安全性评价问题[1]，目前国外对转基因抗除草剂作物的环境风险进行了评估，并作出相关的风险假设，主要与以下三类潜在危害有关：(1)CP4-EPSPS蛋白可能对非目标生物体产生一定的环境风险；(2)宿主植物的转化及其后续CP4-EPSPS的表达可能改变植物的特性，产生一定的环境风险(例如杂草增加)；(3)CP4-EPSPS基因渗入性相容的植物物种可能改变该物种，导致一定的环境风险(例如建立新的杂草种群)。由于转基因作物商品化的历史还非常短，人们对转基因作物大量释放的风险到底有多大还知之甚少，特别是转基因作物大范围长期释放对生态环境的影响更不可能是在短时间内可以了解清楚的。因此科学家们将本着科学、认真的态度对转基因植物可能引起的生态风险进行全面、长期的跟踪评价，同时研究发展监测转基因植物生态风险的新方法和新技术也是非常必要的。目前转基因抗除草剂玉米环境安全评价主要集中在对节肢动物的影响和基因漂移等方面。

1.3 转基因作物中外源蛋白在土壤中降解规律研究

生态系统中的物质循环和能量转化主要是在土壤中进行。目前普遍认为转基因作物外源物质进入土壤的途径主要有以下几种：土壤是生态系统中物质循环和能量转化的重要场所，转BT基因植物外源基因表达的BT蛋白可通过根系分泌物、残茬分解、花粉飘落等途径进入土壤生态系统，并且可以快速吸附在土壤活性颗粒表面，与之紧密结合而避免生物降解，能在较长时间内保持活性[2]。因此，转基因作物的常年种植可能会造成土壤中外源蛋白残留、富集的现象，改变土壤微生物环境系统，打破微生物、植株及土壤三者间的平衡，影响土壤生态系统中的特异生物功能类群以及土壤生物多样性[3-5]，进而影响土壤生态系统的稳定。在土壤环境中失活或消除的途径主要包括三个方面：一是昆虫消耗；二是太阳光中紫外线的降解；三是微生物的降解。在三种降解方式中，以土壤微生物的降解为主。生物作用主要是昆虫消耗和土壤微生物的降解作用。

1.4 先导试验中外源蛋白在土壤中降解的最适环境筛选

在先导试验中，不同含水量(25%、50%、100%)、温度(15 ℃、25 ℃、35 ℃)、pH值(5、7、9)、土壤因素(土壤灭菌处理、土壤非灭菌处理)的条件下，根据混合正交试验设计，测定各个取样时期叶片粉末中CP4-EPSPS蛋白在土壤中的残留量。结果显示，各个处理条件下，土壤中的CP4-EPSPS蛋白残留量均呈前期快速降解后期缓慢降解并逐渐趋于稳定的趋势；随着温度的升高CP4-EPSPS蛋白的降解速度加快，灭菌处理的土壤环境能够加快CP4-EPSPS蛋白的降解速度。鉴于pH值和含水量对该试验的影响较小，故本试验予以忽略。

2 主要内容

以转CP4-EPSPS基因抗除草剂玉米CC-2为材料，分别与取自吉林公主岭、北京上庄、山东济南、河南新乡的干叶混合，在保持温度和含水量恒定的条件下进行掩埋处理，分别在掩埋0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、35、45、60、75、90、105、120 d提取总蛋白，采用ELISA方法检测CP4-EPSPS蛋白在不同土壤中的残留量，利用sigmaplot12.0软件拟合降解方程，计算DT50及DT90，获得其降解曲线，明确CP4-EPSPS蛋白在不同土壤环境中的室内降解规律。

3 材料方法

3.1 供试材料

试验材料转CP4-EPSPS基因抗除草剂基因玉米CC-2采用盆栽的方式种植于室内温室。

三是建立项目整合系统治理模式。湖北省相关部门应整合各部门涉河湖项目资金和资源，统筹水资源保护、水污染防治、水环境保护、水生态修复、水域岸线管理、河湖管理保护监管等工作经费，推广实施山水林田湖草系统治理和水岸人综合治理的项目模式，作为河湖长制专项项目支撑，并纳入长江大保护项目库予以重点支持。

3.2 玉米样品处理及根际土壤样品采集

收集叶片，120℃杀青10min，37℃烘干。将烘干叶片粉碎后过1mm筛，密封保存备用。

试验所用土壤采自吉林公主岭、北京上庄、山东济南、郑州新乡表层(0—20cm)土壤(四种土壤基本理化性质见表1)。将土壤样品在室温下风干并通过1mm筛子，然后将该土壤样品密封保存备用。

表1 供试土壤的基本理化性质

3.3 试验设计

为简化试验，精准获得典型性代表性关键数据，根据先导试验中样地总体环境状况筛选优化出来的试验因素组合，选择蛋白降解速度适中的一组因素条件(即温度为25 ℃、含水量为50%的条件)进行室内模拟CP4-EPSPS外源蛋白降解试验。

3.4 掩埋及取样方法

试验称取0.2g土和0.02g叶均匀混合，装入顶部带有一个2mm小孔的2.0ml离心管中，根据既定的试验方案，加入相应的无菌水，最后利用万分之一天平称量每个离心管的质量并标注。样品准备完毕后统一放入温度为25℃的室内恒温培养箱中，进行室内模拟掩埋，每隔一天按照称量前后的样品重量差补加无菌水，每相差0.01g补水10μl，以保持每个样品含水量恒定，每个处理3次重复。

共设置33个取样时间点，分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、35、45、60、75、90、105、120d，每次取3次重复进行检测；将每个处理取出并标注清楚后放入-80℃冰箱统一检测。

3.5 CP4-EPSPS蛋白测定

用ELISA酶联免疫试剂盒进行检测。

3.6 数据处理与统计分析

利用Excel将ELISA检测数据进行初步整理汇总，导入SPSS软件中进行方差分析，再导入SigmaPlot 12.0软件，将各因素影响下，CP4-EPSPS蛋白降解的残留量与降解天数之间建立起数学模型关系，得出CP4-EPSPS蛋白的降解曲线图；根据ELISA检测数据求出方程的参数值，最终确定函数拟合模型；最后用Excel求出具体的DT50和DT90值，并分析CP4-EPSPS蛋白降解规律。

4 结果与分析

4.1 相关性分析

通过表2可知，不同的土壤理化性质会对外源蛋白在土壤中的降解规律产生不同程度的影响，其中与有机质和有效磷含量均达到显著相关，说明有机质和有效磷含量高的土壤有利于CP4-EPSPS蛋白在土壤中的降解。

4.2 降解规律

CP4-EPSPS蛋白在土壤中的降解动态如图1所示，各处理CP4-EPSPS蛋白含量从左向右呈指数下降趋势，CP4-EPSPS蛋白的初始含量(降解处理0d)均为100%，随着掩埋天数的增加，蛋白含量均呈下降趋势。观察CP4-EPSPS蛋白在四种不同的土壤环境下的降解趋势不难发现，CP4-EPSPS蛋白均呈现出前期降解速度较快、后期逐渐缓慢并最终趋于稳定的趋势。

表2 土壤理化性质相关性分析

注：XX：新乡；JN：济南；BJ：北京；GZL：公主岭。

纵向比较发现，在公主岭的土壤环境下，CP4-EPSPS蛋白在0—1.68d的降解速度最快，降解了50%，1.68—5.79d的降解速度逐渐缓慢，降解了90%，且于第5.79d后逐渐趋于稳定；北京的土壤环境下，CP4-EPSPS蛋白在0—1.88d降解速度最快，降解了50%，1.88—5.84d降解速度逐渐缓慢，降解了90%，且于5.84d以后逐渐趋于稳定；在济南的土壤环境下，CP4-EPSPS蛋白在0—1.95d的降解速度最快，降解了50%，1.95—6.54d降解速度逐渐缓慢，降解了90%，且于6.54d以后逐渐趋于稳定；在新乡的土壤环境下，CP4-EPSPS蛋白在0—2.38d的降解速度最快，降解了50%，2.38—7.44d后降解速度逐渐缓慢，降解了90%，且于7.44d后逐渐趋于稳定。

各土壤环境相互比较发现，经过相同的降解时间，CP4-EPSPS蛋白的降解残留量在新乡的土壤环境下最高，在公主岭的土壤环境下最低，其相应的蛋白残留量从高到低排列为：新乡>济南>北京>公主岭。

4.3 模型拟合

本试验中4组处理下CP4-EPSPS蛋白降解指数模型见表3。从表3中可以看出，所有处理的模型相关系数R值在0.993—0.999(p<0.001)，表明该模型能较好地拟合该蛋白的降解过程。在四种不同土壤环境下，CP4-EPSPS蛋白的DT50分别为新乡2.38d、济南1.95d、北京1.88d、公主岭1.68d；其DT90分别为新乡7.44d、济南6.54d、北京5.84d、公主岭5.79d，表明CP4-EPSPS蛋白在公主岭的土壤环境下降解速度较快。

各土壤环境相互比较发现，CP4-EPSPS蛋白在公主岭的土壤环境下降解速度最快，在新乡的土壤环境下降解速度最慢，其相应的蛋白降解速度从快到慢排列为：公主岭>北京>济南>新乡。

表3 CP4-EPSPS蛋白在土壤中降解的指数模型

5 结论

本研究中，使用四种土壤中的CP4-EPSPS蛋白初始值相同均为100%，在其他环境条件，温度、含水量等均一致的情况下，随着掩埋天数的增加，CP4-EPSPS蛋白的含量均发生不一样的变化，在试验前期大量快速降解，中后期少量缓慢降解，降解动态符合指数方程。

本试验表明土壤活性颗粒对CP4-EPSPS 蛋白有吸附作用[6]，通过与具有表面活性的土壤微粒结合，抑制土壤中外源蛋白的降解，吸附后CP4-EPSPS 蛋白就不能或极少被土壤微生物作为碳、氮源利用，造成CP4-EPSPS蛋白在土壤中长期存在并富集[7]。转抗除草剂玉米中的CP4-EPSPS蛋白在土壤微生物的作用下，均能被慢慢降解，只有少数残留，对土壤环境没有明显持续的负面影响[8]。因此，为了更加全面地评价其对生态环境的安全性，可进一步考虑将降解试验扩大到田间，将室内模拟环境条件转变成田间生态环境，从而对该试验进行更加细致和长期的环境安全监测。秸秆还田作为一种重要的途径，既能够在生态农业的发展形势下合理利用农业资源，又与本试验的理念相符合，可以本试验的结果作为理论基础[8]。