骨碎补总黄酮对卵巢去势大鼠骨质疏松的干预作用

陈学生 张洪钦 陈秋琴 林 立 王永胜，4▲

1.厦门大学附属福州第二医院输血科，福建福州 350007；2.厦门大学附属福州第二医院药剂科，福建福州 350007；3.厦门大学附属福州第二医院儿科，福建福州 350007；4.复旦大学附属中山医院厦门医院药剂科，福建厦门 361015

骨质疏松（OP）是严重威胁绝经后女性健康的重要因素。OP 是一种以骨量降低、骨微观结构损坏及骨脆性增加等为特征的全身性骨骼疾病，且易导致骨折[1]。由于起病隐匿，早期无典型症状，后期多引发疼痛或骨折时才得以确诊[2]。近年来OP 治疗方法经验不断丰富，研究者也努力从具有治疗作用的中药中提取有效成分，深入分子作用通路机制研究[3-4]。目前已证实骨碎补对骨损伤、OP 等具有良好的防治作用，由于其成分多样，主要有黄酮、三萜、酚酸及其苷类等，其有效成分尚不明确，因此深入研究骨碎补防治OP 有效成分的药理作用具有重要意义。本研究通过制备卵巢摘除诱导OP 模型观察骨碎补总黄酮对大鼠OP 的干预作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

强骨胶囊（含骨碎补总黄酮有效成分0.142 g，总黄酮含量≥80%，生产批号：181101，北京歧黄制药有限公司）。大鼠血清骨转化标志物骨钙素（BGP）试剂盒（生产批号：20190222）、大鼠血清甲状腺素（PTH）试剂盒（生产批号：20190318）、大鼠血清骨碱性磷酸酶（BALP）试剂盒（生产批号：20190318）。以上试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。包埋机（型号：BMJ-A，常州中威电子仪器），显微镜（型号：BA210T，麦克奥迪实业集团有限公司），双能X 线骨密度仪（DXA）（型号：LUNAR-Prodigy，美国GE 公司）。

1.2 研究对象

选取50 只体重70～90 g 的3月龄无特定病原（SPF）级健康雌性斯普拉格-杜勒（SD）大鼠，购自于上海斯莱克实验动物有限责任公司[编号：SCXK（沪2007-0005）]。饲养环境保持通风换气，氨浓度控制小于20 ppm，室内温度控制18～29℃，相对湿度达40%～70%，空气换气次数10 次/h，气流速度≤0.18 m/s。本研究动物实验经福州市第二医院实验动物伦理委员会审核同意。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及造模 将其中的21 只SD 大鼠按照随机数字表法分为三组：空白组、模型组、治疗组（每组各7 只）。依次沿动物两侧软肋下皮肤剪开，并分离出皮肤的筋膜和腹膜脏层，在暴露腹腔后随后切除模型组和治疗组大鼠双侧卵巢，分层缝合、消毒。空白组不做卵巢切除处理。

1.3.2 给药及取材 术后普通饲养3 个月开始给药。空白组和模型组给予蒸馏水灌胃。根据大鼠与人的体表面积比例拟定大鼠的骨碎补给药剂量。治疗组予0.054 g/（kg·d）骨碎补总黄酮灌胃。首次干预前进行骨密度（BMD）检测，随后连续灌胃给药3 个月，取材前再次检测BMD。取材前绝对禁食24 h，用10%水合氯醛给予0.3 mL/100 g 体重剂量肌内注射深度麻醉，抽取腹主动脉血5 mL，3000 r/min 离心5 min，分离血清，-20℃保存待用。抽血完毕依次分离附着股骨干骺端的肌肉和解体组织，暴露其股骨头，用洁净咬骨钳将其钳碎，用无菌EP 管收集并标记。

1.3.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中BGP、BALP、PTH 参照ELISA 检测试剂盒的操作说明书，在450 nm 波长下使用酶标仪测量相应吸光度值，绘制其标准曲线，计算各组BGP、BALP、PTH 水平，计算样品实际浓度。

1.3.4 BMD 检测 10%水合氯醛对大鼠深度麻醉后，大鼠正位放置定位板，四肢伸展。应用DXA 系统采用小动物模式扫描，测量各组大鼠左侧股骨BMD。

1.3.5 苏木精-伊红（HE）染色 大鼠股骨组织剪碎约3 mm，4℃下在4%多聚甲醛液（pH=7.4）中固定48 h。使用10%乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）（pH=7.4）在4℃条件下脱钙1 个月，脱钙液每周更换1 次。脱钙结束，石蜡包埋连续切片。切片的厚度约4 μm，置65℃的恒温烘箱中烤6 h。将组织切片常规脱蜡染色制片。光学显微镜下观察HE 染色情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，任意两组比较采用LSD-t 检验，组内比较采用配对t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠干预后BMD 的比较

干预前，模型组的BMD 低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组的BMD 与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。干预后，空白组和治疗组的BMD 高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组的BMD 低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）。三组干预前后组内的BMD 比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1、图1）。

表1 三组大鼠干预后BMD 的比较（mg/cm2，±s）

表1 三组大鼠干预后BMD 的比较（mg/cm2，±s）

与模型组同期比较，*P＜0.05；与空白组同期比较，#P＜0.05

组别 只数 干预前 干预后 t 值 P 值空白组模型组治疗组777 0.477±0.005*0.369±0.013 0.364±0.018#0.481±0.007*0.358±0.011 0.386±0.005*#2.236 2.051 2.698 0.089 0.110 0.054

2.2 三组大鼠骨转化生物标志物水平的比较

模型组的BGP 低于空白组，BALP、PTH 高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组的BGP 低于空白组，BALP、PTH 高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组的BGP 高于模型组，BALP、PTH低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 三组大鼠骨转化生物标志物水平的比较（±s）

表2 三组大鼠骨转化生物标志物水平的比较（±s）

与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 只数 BGP（μg/L） BALP（IU/L） PTH（pmol/L）空白组模型组治疗组777 1.79±0.14 0.68±0.14*1.45±0.22*#100.79±11.69 192.73±24.23*139.45±11.91*#28.16±1.27 49.78±3.22*39.92±4.64*#

2.3 三组大鼠的股骨组织病理学情况

空白组大鼠的股骨组织形态结构较为完整，大鼠股骨干骺端骨小梁连接致密，网状结构完整。与空白组相比，模型组骨小梁数目减少，骨小梁间连接稀疏间距变大，网状结构被破坏严重，骨髓腔融合较严重。相比模型组，治疗组骨小梁微结构有一定程度的改善，骨小梁数量增多，其连接点也见增多（图2，封三）。

3 讨论

绝经后OP 为高转换型OP，即骨吸收与骨形成都比较活跃，但以骨吸收为主。绝经后OP 主要表现为骨量迅速丢失，骨折多以股骨上端为主[5]。不同部位骨骼的骨质成分不同，皮质骨或密质骨构成长骨骨干和所有骨的外层，而小梁骨或松质骨构成骨骼的内层[6]。妇女绝经后由于卵巢功能衰退，导致机体雌激素水平下降，继发甲状旁腺功能亢进，甲状旁腺激素分泌增多，而降钙素分泌不足，骨重建单位进行负平衡活动，骨吸收大于骨形成[7-8]。小梁骨在绝经早期迅速丢失致骨折风险增加，皮质骨丢失较缓慢，但较持续，随着小梁骨和皮质骨的丢失，髋部的骨折风险增加[9]。

骨碎补的主要生物活性成分为黄酮类化合物，因其潜在的药用价值而备受关注，在基础及临床研究中广泛应用[10]。以往实验已证实骨碎补对卵巢切除所致的骨高转换有明显的抑制效应，骨碎补能抑制破骨细胞的生长，不仅对破骨母细胞向成熟破骨细胞转化有抑制作用，而且对破骨细胞性骨吸收有抑制作用[11-13]。DXA 测量髋部、全身是目前最常用、成熟的测量方法，具有较好的重复性、辐射量低等优点，DXA 的BMD结果与骨折风险相关性已被广泛认可，是多数临床药物研究疗效观察采用的测量方法[14]。本研究通过对比骨碎补总黄酮干预前后各组间BMD 变化，结果提示，模型组和给药组干预前的BMD 比较，差异无统计学意义（P>0.05）；干预后，治疗组骨量丢失情况较OP 模型组有所改善。HE 染色镜下可见治疗组骨小梁微结构有所改善，骨小梁数量和连接点相应增多。

目前骨转换生化标志物已广泛应用于临床诊疗、研究中，骨形成标志物有BGP、BALP 等，骨吸收指标包括PTH 和性激素等[15-16]。血清中的BGP 在骨吸收或形成能力增强时会增加，具有较强的敏感性和特异性。BALP 在骨组织中较为活跃，因此发生OP 时，BALP 亦可上升[17]。骨碎补总黄酮具有促进骨形成标志物BGP、BALP 水平与活性，并抑制骨吸收标志物PTH 水平。骨转换生化标志物虽不能完全作为OP诊断的金标准，但结合BMD，可较早地获悉骨转换动态，因此在监测抗OP 的治疗效果等方面具有重要作用[18-19]。

综上所述，对去势诱导的OP 给予骨碎补有效成分总黄酮干预具有良好的改善作用，对今后在药品开发和临床实际应用中具有重要的指导意义。

图2 大鼠股骨组织病理图（HE 染色，400×）（见内文第6页）