循环血肿瘤细胞检测在根治性膀胱全切术后评估中的临床研究

康 曦 李 琴 刘 方

江西省萍乡市人民医院泌尿外科，江西萍乡 337000

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，病死率和发病率居于我国泌尿系统肿瘤的首位，多呈浸润性发展，恶性程度较高[1]。根治性膀胱全切术是治疗膀胱癌的有效手段，但5年生存率仅为26%～64%，大部分患者死于肿瘤转移，目前尚无有效的方法预测膀胱肿瘤的复发、进展、转移以及评估术后治疗效果[2-3]。血行传播是恶性肿瘤远处转移的重要途径，循环血肿瘤细胞（CTC）是指从原发病灶脱落进入血液循环的细胞，在一定条件可在远处器官定植，形成恶性肿瘤转移病灶，其存在是血行传播的表现[4-5]。CTC 与直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤的转移、复发相关，是对恶性肿瘤患者无瘤生存预测的重要指标[6]。本研究旨在分析CTC 检测在根治性膀胱全切术后评估中的应用价值，为临床个体化治疗方案的选择提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年6月～2019年10月萍乡市人民医院门诊就诊，拟行根治性膀胱全切术的90 例膀胱癌患者作为研究组，选择同期就诊于萍乡市人民医院的10 例非肿瘤患者作为对照组。研究组中，男61 例，女29 例；年龄41～78 岁，平均（66.24±8.67）岁；肿瘤直径≥3 cm 有38 例，＜3 cm 有52 例；多发肿瘤28 例，单发肿瘤62 例；鳞状细胞癌1 例，单纯尿路上皮癌77 例，尿路上皮癌合并小细胞神经内分泌癌1 例，尿路上皮癌合并鳞状或腺样分化11 例。对照组中，男6例，女4 例；年龄40～81 岁，平均（66.31±8.75）岁；肾盂输尿管连接处狭窄3 例，结石6 例，精索静脉曲张1 例。两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医学伦理委员会审核批准。纳入标准： ①研究组患者均经病理诊断确诊为膀胱癌者；②美国麻醉医师协会（ASA）分级为Ⅰ～Ⅲ级者；③术前未接受任何抗肿瘤治疗者；④行根治性膀胱全切术治疗者；⑤签署知情同意书者；⑥对照组为非肿瘤患者。排除标准：①合并其他恶性肿瘤者；②术前发现存在远处转移者；③精神疾患者。

1.2 方法

采用用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝真空采血管采集两组患者7.5 mL，24 h 内富集处理。混匀后，置入50 mL 离心管中，配置3 种工作液，命名为A1、B1、C1。加A1 至45 mL，室温下行5 min 的1900 r/min 离心操作，去除血红素、血红蛋白。加入B1 混匀，裂解红细胞，室温下行5 min 的1900 r/min 离心操作，将红细胞裂解基质去除，所沉淀下来的即为稀有细胞和白细胞。吸取适量磁微粒，每份150 μL，混悬液置入2 mL的EP 管中，磁力架洗涤3 次。每份100 μL 比例在上述样本中缓慢置入磁微粒，摇晃离心管，磁微粒充分混匀后，在摇床上摇动20 min，促使白细胞与磁珠结合。取3 mL C1 加入50mL 离心管，在顶层加入已处理好的样本，按照密度梯度离心原理将磁珠和白细胞去除。行5 min 的1400 r/min 离心操作，吸取最上两层溶液，放置在15 mL 离心管中，加入A1，行5 min的2300 r/min 离心操作，弃上清至300 μL。移动上述液体至2 mL 离心管，靠于磁力架2 min，将残留磁珠去除，室温下行3400 r/min 离心操作，弃上清至60 μL，滴加体积相等的固定液，混匀，涂片。取200 μL 固定液，使其完全覆盖标本区域，置于室温下8 min。将固定液吸除，脱水，分别将10 μL CEP8 探针加入每个标本区，盖上盖玻片。吸取200 μL 封片胶将玻片边缘封住，加入载玻片放入杂交仪，变形76℃，5 min，杂交37℃，1.5 h。将标本片取出，封片胶撕去，去除盖玻片，洗片，染色，避光保存。利用荧光显微镜读片，CTC 标准（图1～4，封三）：CD45 阴性，FISH 阳性（40 倍镜下信号不分层，CEP8 探针信号≥3），单个细胞。

1.3 观察指标及评价标准

比较两组CTC 阳性率，分析CTC 阳性率与膀胱癌患者临床病理特征关系、CTC 表达水平与膀胱癌患者预后的关系。其中临床病理特征包括性别、年龄、吸烟史、肿瘤直径、肿瘤数目、组织学类型、肾积水、病理分级、T 分期、复发情况等。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件分析数据，计量资料使用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，Log-rank检验分别比较CTC 表达水平膀胱癌患者的生存差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者CTC 阳性率的比较

对照组中未检出CTC，研究组中检出CTC 有31例，阳性率为34.44%，CTC 数值为1～10 个。研究组CTC阳性率高于对照组，差异有统计学意义（χ2=4.992，P=0.025）。

2.2 CTC 阳性率与膀胱癌患者临床病理特征关系分析

不同性别、年龄、组织学类型和是否有吸烟史、肾积水患者CTC 阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；多发肿瘤CTC 阳性率高于单发，肿瘤直径≥3 cm 的CTC 阳性率高于＜3 cm 的CTC 阳性率，≥T2 分期CTC阳性率高于＜T2 分期的CTC 阳性率，高级别肿瘤的CTC 阳性率高于低级别肿瘤的CTC 阳性率，复发患者的CTC 阳性率高于无复发患者的CTC 阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 CTC 阳性率与膀胱癌患者临床病理特征关系分析

2.3 CTC 表达水平与膀胱癌患者预后的关系

术后行长期定时随访，每3 个月复查随访一次。生存曲线显示，CTC 阳性表达生存率高于无CTC 阳性表达患者，差异有统计学意义（P＜0.05）（图5）。

图1 CD45 阴性（见内文第124页）

图2 CEP8 阳性（见内文第124页）

图3 细胞核（见内文第124页）

图4 FISH 阳性细胞合成图（见内文第124页）

图5 CTC 表达与膀胱癌患者预后的关系

3 讨论

膀胱癌是具有高复发、浸润发展等特点的泌尿系统恶性肿瘤，手术是治疗膀胱癌的主要方式，但术后远处转移和高复发率是治疗膀胱癌的主要问题之一[7]。约50%的浸润性膀胱癌在确诊时已发生微转移灶。微转移是机体体液、组织和细胞移植物中检测到镜下和亚显微水平的肿瘤残留，是隐匿于原发灶以外的组织、非血液系统的恶性肿瘤的转移，其发生与肿瘤组织学分级、肿瘤类型相关。微转移灶的存在提示在临床转移症状出现之前，癌细胞在很长一段时间内便与原发灶脱落播散至循环系统中，即CTC，是肿瘤复发、转移的最直接因素[8-11]。CTC 数量与术后总生存期和无病生存期关系密切，数量越多者术后复发率越大[12-13]。因此，检测膀胱癌患者外周血肿CTC，对于评价膀胱癌疗效和评估预后具有积极意义。

血液中CTC 的含量极其稀少，检测CTC 前需实施富集，免疫磁珠法为常用的富集方法，包括阳性、阴性富集法，前者是让带有特异性抗体的免疫磁珠结合肿瘤细胞表面抗原，形成复合物，促使肿瘤细胞在磁场中停留，但因部分肿瘤细胞无表达特异性抗原，易出现假阴性结果。而阴性富集法是通过免疫磁珠结合非肿瘤细胞，使其在磁场中停留，通过磁场富集肿瘤细胞，检出率更高[14-15]。本研究中，研究组的CTC 阳性率高于对照组；多发肿瘤的CTC 阳性率高于单发肿瘤的CTC 阳性率，肿瘤直径≥3 cm 的CTC 阳性率高于＜3 cm 的CTC 阳性率，≥T2 分期的CTC 阳性率高于＜T2 分期的CTC 阳性率，高级别肿瘤的CTC 阳性率高于低级别肿瘤的CTC 阳性率，复发患者的CTC阳性率高于无复发患者的CTC 阳性率； 生存曲线显示，CTC 阳性表达生存率高于无CTC 阳性表达患者，提示CTC 与膀胱癌的发生、进展、预后密切相关。CTC检测样本易于获取，具有易动态监测、近似无创、高敏感性等优点，与影像学和组织学比较，CTC 能更早发现肿瘤，动态监测CTC 能间接反映肿瘤血行转移速度、病情严重程度、治疗后残存肿瘤细胞，可能成为一种新型评价肿瘤疗效和评估预后的手段，应用前景广泛。

综上所述，CTC 与膀胱癌患者肿瘤数目、肿瘤直径、病理分级、T 分期、复发密切相关，动态检测CTC 利于及时评估疗效、尽早发现复发转移和预后，指导临床选择和个体化、合理化的治疗方案。