番茄SlGRAS4基因特征分析和耐热功能鉴定

朱珍花，蒋芳玲，文军琴，石潇瀑，吴翠云，刘 敏，吴 震

(南京农业大学 园艺学院，农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室，南京 210095)

高温对植物的生长发育和产量均造成不利影响，为此植物进化形成相应的调节机制和调控网络。热激转录因子(heat shock transcription factors，Hsfs)和热激蛋白(heat shock proteins，Hsps)是高温胁迫响应机制的重要组成部分。Hsfs通过调控自身及靶基因的转录水平来响应高温胁迫[1]。HSP在复原热激变性蛋白质以及调节蛋白质质量方面起关键作用。活性氧(ROS)是高温胁迫引起的应激信号分子[1]。植物中的ROS水平会影响Hsfs和Hsps的表达，从而对高温胁迫做出响应[2-3]。ROS信号转录因子ZAT10和ZAT12参与高温逆境调节[4-5]。这些发现表明高温信号和ROS信号转导之间是相互关联的。活性氧(ROS)清除酶是热激诱导的主要功能蛋白，包括过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸酶(APX)等，它们在高温胁迫下清除植物体内过量产生的ROS，从而减轻植物遭受的氧化伤害[1,6]。除了Hsf和ZAT两个转录因子家族外，目前报道参与高温逆境胁迫响应的转录因子家族还包括NAC、ERF、WRKY、bZIP和MYB等[7]。

GRAS是植物体内普遍存在的转录因子家族，包括3个初始成员GAI(gibberellin-acid insensitive)、RGA(the repressor of GA1-3 mutant)和SCR(scarecrow)，这3个成员的表达产物具有高度的结构和序列相似性，因此GRAS家族就取GAI、RGA、SCR的关键字母进行命名[8]。GRAS在植物发育和信号转导途径中起关键作用，包括芽分生组织状态维持[9]，腋芽分生组织进化[10]，配子发生[11]，植物铬信号以及叶绿素a和b信号传导[12]，植物休眠[13]，赤霉素的生物合成和信号转导[14]，生长素信号转导[15]等。GRAS家族基因在植物抵抗非生物胁迫方面也具有重要作用。研究表明，胡杨GRAS家族基因PeSCL7在拟南芥中的过表达株系表现出更好的耐旱性和耐盐性[16]；过表达OsGRAS23水稻株系的耐旱和抗氧化能力均有增强[17]；葡萄GRAS家族基因VaPAT1在拟南芥中的过表达株系抗旱性、抗冷性和耐盐性均增强[18]；转核桃JrGRAS2基因酵母在36 ℃胁迫下表现出更高的生存活性[19]。然而GRAS家族转录因子是否参与植物高温逆境调控还缺少研究，其调控机理更少有报道。

番茄(SolanumlycopersicumL.)是重要的蔬菜作物，因其果实具有很高的营养价值，深受消费者喜爱并在全球范围内广泛栽培。番茄喜温暖，但对高温敏感。番茄中有53个GRAS家族成员[20]，前人利用转基因技术鉴定了该家族部分成员在番茄逆境调控中的功能。研究表明，沉默SlGRAS6提高了由丁香假单胞菌引起的番茄细菌性斑点病的发病率[21]；沉默SlGRAS43番茄植株在干旱胁迫下丙二醛含量上升，脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性下降[22]；SlGRAS40过表达株系增强了番茄耐盐和抗旱能力[23]；SlGRAS7过表达番茄株系表现出更高的抗旱性和耐盐性[24]。目前，还未见GRAS家族成员基因参与番茄耐热调控的报道。

在之前研究中，Wen等[25]以醋栗番茄LA2093为材料通过RNA-Seq分析发现SlGRAS4基因在高温胁迫后显著诱导表达，推测该基因参与番茄高温胁迫响应，并且可能在番茄高温胁迫响应中发挥重要作用。为分析SlGRAS4基因特征，明确其在番茄耐热中的作用，本研究首先利用生物信息学分析法预测了SlGRAS4生物功能，然后利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在逆境胁迫和激素处理下的表达特征，最后利用病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)抑制该基因在番茄植株中的表达，测定高温处理下相关生理指标和基因表达量变化。鉴定SlGRAS4基因在番茄中的耐热功能，不仅证明了GRAS基因家族与番茄耐热之间的联系，而且丰富了番茄耐高温调控机制。

1 材料和方法

1.1 植物材料和培养条件

试验材料为醋栗番茄LA2093(SolanumpimpinellifoliumL.)，种子由南京农业大学蔬菜生理生态实验室提供。番茄种子经过浸泡和催芽处理后播种于基质配比为泥炭∶蛭石∶珍珠岩(V∶V∶V)=2∶1∶1的72孔穴盘中，并放置在光培箱中培养(东南仪器，RDN-560E-4，中国)，生长条件为温度25 ℃/18 ℃(昼/夜)、光周期14 h/10 h(昼/夜)、光合有效辐射为360 μmol·m-2·s-1、相对湿度75%，沉默植株侵染后温度调整为22 ℃/18 ℃(昼/夜)。当第2片真叶完全展开后，将生长一致的幼苗移栽到32孔穴盘中，其中不同胁迫和激素处理的番茄幼苗经过洗根后移栽至无土栽培基质[蛭石∶珍珠岩(V∶V)=1∶1]中，试验材料均浇1倍的田园式营养液。

1.2 方 法

1.2.1SlGRAS4生物信息学分析利用在线网站Gene Structure Display Server 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)比对SlGRAS4基因组DNA和全长cDNA，得到内含子外显子结构图。SlGRAS4蛋白质的分子量、等电点等通过在线计算工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam)获得。SlGRAS4蛋白结构域分析结果利用在线网站InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)获取。利用PlantCare数据库(http://bioinformatics.Psb.Ugent.be/webtools/plantcare/html/)对SlGRAS4基因起始密码子上游2 000 bp启动子区序列进行分析。利用NCBI数据库中的Blastp同源比对工具，搜索并下载SlGRAS4同源蛋白序列。利用DNAMAN8对SlGRAS4及其同源蛋白进行比对分析，构建简单进化树。通过在线工具MEME(http://meme-suite.org/took/meme)获得SlGRAS4及其同源蛋白保守基序。

1.2.2SlGRAS4在不同胁迫和激素处理下的表达分析LA2093生长至5叶1心时进行不同胁迫和激素处理。对照为蒸馏水2 L；PEG6000模拟缺水胁迫处理：蒸馏水2 L +20% PEG6000；NaCl模拟盐胁迫处理：2 L蒸馏水+200 mmol/L NaCl；ABA处理：2 L蒸馏水+200 μmol/L ABA；SA处理：2 L蒸馏水+200 μmol/L SA。分别在处理0、4、8和12 h后取番茄幼苗自顶部向下数第2片完全展开真叶，每个时间点3次生物学重复，每个重复取2株混样，每次取样后的植株不再用于重复取样，取样后利用液氮速冻并保存至-80 ℃超低温冰箱。

利用Trizol 试剂盒(Invitrogen，美国)提取各样品总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本完整性，NanoDrop 2000紫外可见分光光度计测定其浓度及纯度。利用5×All-In-One RT MasterMix反转录试剂盒(Abm，加拿大)完成 cDNA 合成和纯化。SlGRAS4的qPCR引物(表1)引用于qPrimerDB数据库(https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/)。利用TOROGreen®qPCR Master Mix 试剂盒(Toroivd，英国)在Quantstudio3实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)上按说明进行PCR试验。反应体系：5 μLTOROGreen®qPCR Master Mix，1 μL cDNA模板，上下游引物各0.4 μL，3.2 μL ddH2O。反应程序：95 ℃预变性60 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，40个循环。进行熔解曲线分析，范围为60～95 ℃，以验证每个引物对扩增特异性。Actin作为内参基因，通过2-ΔΔCT计算SlGRAS4基因相对表达量。

1.2.3 VSlGRAS4植株获取利用Sol Genomics Network(https://solgenomics.net/)中VIGS Tool工具选取SlGRAS4基因CDS区500 bp序列作为沉默片段，利用诺唯赞公司(南京，中国)CE Design V1.04软件单片段克隆法设计正反向5′端引入线性化载体两末端同源序列的引物(表1)，以LA2093叶片的cDNA为模板克隆该沉默片段并测序。用限制性内切酶XbaⅠ-HF和KpnⅠ(NEB，中国)将TRV2载体线性化，利用同源重组试剂盒Clone Express Ⅱ One Step Cloning Kit(诺唯赞，南京)将其与测序结果正确的SlGRAS4沉默序列连接，并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌落经PCR鉴定后，进一步测序获得正确阳性克隆。提取阳性克隆中的质粒转化农杆菌GV3101，即得到阳性工程菌。分别将农杆菌pTRV1、pTRV2、pTRV2-SlGRAS4单菌落扩大培养并重悬于渗透缓冲液(10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES、200 μmol·L-1AS，pH5.6)中，调节缓冲液中菌液OD600为1.0，室温黑暗静置3 h。将含有pTRV1农杆菌的渗透液分别与含有pTRV2、pTRV2-SlGRAS4农杆菌的渗透液按1∶1比例混合配置成侵染液。待醋栗番茄LA2093幼苗第1片真叶显现时，用1 mL注射器将配置好的侵染液注射到番茄子叶中。其中pTRV1农杆菌和pTRV2农杆菌混合侵染植株作为对照植株(V-empty，Ve)，pTRV1农杆菌和pTRV2-SlGRAS4农杆菌混合侵染植株作为沉默植株(VSlGRAS4)，并于接种第20天取第2片叶检测SlGRAS4的表达量。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.4 VSlGRAS4植株耐高温能力鉴定Ve植株和VSlGRAS4植株生长至5叶1心时，对其进行高温(40 ℃/40 ℃，昼/夜)处理和相关指标测定。在高温处理0、12、24 h时，从上往下数取第3片叶测定过氧化氢(H2O2)含量和光系统Ⅱ最大光化学量子产量(Fv/Fm)，取第4片叶测定电导率(REL)；在高温处理0、4、8 h时，从上往下数取第2片叶测定基因表达量，取第3片叶测定SOD、POD、APX活性。REL和Fv/Fm测定使用新鲜样品，其他样品取样后立即用液氮速冻并储存在-80 ℃超低温冰箱。各项指标测定均≥3次生物学重复，每个重复取2株混样，每次取样后的植株不再用于重复取样。

REL的测定参照Cao等报道的方法[26]；Fv/Fm利用便携式荧光仪测量；H2O2含量测定参照Uchida等报道的方法[27]。SOD、POD和APX活性测定参照Beyer和Nakano等报道的方法[28-29]。

1.2.5 VSlGRAS4植株高温和ROS信号应答基因表达量分析将样品从超低温冰箱中取出，参考1.2.2 方法完成总RNA提取和反转录，Actin作为内参基因，高温信号应答基因HsfA1a、HsfA1b、Hsp90和ROS信号应答基因ZAT10、ZAT12、CuZnSOD、FeSOD、CAT、APX1、APX2定量引物引用于qPrimerDB数据库(表1)。利用上述相同PCR体系和程序完成试验，通过2-ΔΔCT法计算各基因的相对表达量。

1.3 数据处理

测定结果均为3次生物学重复的平均值±SE。利用SPSS(25.0)统计软件进行方差分析和差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 SlGRAS4生物信息学分析

为研究SlGRAS4基因特征和生物功能，本研究对SlGRAS4进行了生物信息学分析。SlGRAS4前体mRNA通过不同的剪接方式产生两条成熟mRNA。mRNA1没有内含子，CDS长度为2 000 bp；mRNA2在5′非翻译区(5′-UTR)区有一个内含子，CDS长度为1 928 bp，mRNA2是与mRNA1编码序列完全相同的一段序列(图1，A)，因此本研究仅对mRNA1编码蛋白进行生物信息学分析。SlGRAS4蛋白长度为666 aa，分子量为75 737.72 Da，理论等电点为6.31，含有GRAS转录因子家族典型的结构域，主要集中在C末端的277～657 aa之间(图1，B)。利用PlantCare数据库检测到SlGRAS4启动子区域的多种逆境响应元件，包括脱落酸响应元件ABRE，茉莉酸响应元件CGTCA-motif、TGACG-motif，伤口响应元件WUN-motif等(图1，C)。利用NCBI查找SlGRAS4同源蛋白序列，发现SlGRAS4与烟草NtGRAS1(Nicotianatabacum)、麻风树JcGRAS05(jatrophacurcas)、杨树PtSCL14(Populus)、拟南芥AtSCL14(Arabidopsisthaliana)蛋白具有相似性，其中与NtGRAS1蛋白亲缘关系最近，同源序列主要集中在C端，包含3个保守基序(conserved motif)(图2，A-C)，由此推测SlGRAS4可能与其同源基因具有相似的生物功能。

2.2 SlGRAS4在不同逆境胁迫和激素处理下的表达分析

为了探究SlGRAS4非生物胁迫响应功能，本研究分析了SlGRAS4在不同非生物胁迫和激素处理下的表达水平。在高温、低温、干旱和盐胁迫以及ABA和SA激素处理下，SlGRAS4均被诱导表达。SlGRAS4在高温、低温、盐和干旱胁迫处理12 h内表达量不断上升，且在处理12 h时表达量升至最高，分别增加到对照的8.86、4.86、55.38和7.63倍。SlGRAS4在ABA和SA激素处理12 h内表达量先上升后下降，且在处理8 h时表达量达到峰值，分别增加到对照的120.72和3.55倍(图3)。这说明SlGRAS4可能参与了多种非生物胁迫响应和激素信号传导。

图3 SlGRAS4在不同非生物胁迫和激素处理下表达分析Fig.3 Expression analysis of SlGRAS4 gene under different abiotic stress and hormone treatments

2.3 沉默SlGRAS4降低了番茄耐高温胁迫能力

PCR扩增条带和大肠杆菌菌落PCR鉴定结果均为500 bp左右，与目标SlGRAS4沉默片段(527 bp)大小相一致(图4，A)，经测序确认正确并进行特异性分析后获得阳性工程菌。取7株五叶一心的VSlGRAS4植株进行沉默效率检测，相对于Ve植株，VSlGRAS4植株中SlGRAS4表达量均有不同程度的下降，下降范围在34%～82%之间(图4，B)，这说明SlGRAS4基因被有效沉默。

为了研究沉默SlGRAS4基因对番茄耐高温胁迫能力的影响，本研究检测了高温胁迫下VSlGRAS4和Ve植株表型以及生理指标变化。取VSlGRAS4和Ve植株各8株进行表型差异分析，分别在高温处理前和二者表型出现差异时拍照记录。高温处理36 h时，Ve植株正常生长，VSlGRAS4植株叶片高度聚拢，部分叶片出现萎蔫，表现出高温伤害症状(图5，A)。VSlGRAS4和Ve植株的各项生理指标在正常温度下均无显著性差异(图5，B-G)。高温处理12 h时，VSlGRAS4植株REL和H2O2含量显著高于Ve植株(图5，B、C)。在高温处理24 h内，随着处理时间的延长，VSlGRAS4和Ve植株的Fv/Fm均下降，且在处理12和24 h时，VSlGRAS4植株Fv/Fm分别下降为Ve植株的95.27%和46.76%(图5，D)。高温处理8 h时，VSlGRAS4植株SOD和POD活性相对于Ve植株显著降低(图5，E、F)；高温处理下，VSlGRAS4植株APX活性相对于Ve植株降低，但差异性不显著(图5，G)。这些结果均表明SlGRAS4提高了番茄耐高温胁迫能力。

A.内含子外显子结构；B.编码蛋白结构域；C.启动子区顺式作用元件；标尺在图A和B中分别代表mRNA和蛋白长度，在图C中代表顺式元件在启动子区域位置图1 SlGRAS4基因特征分析A.Intron and exon structure;B.Coding protein domain;C.Cis-acting elements in the promoter region The ruler represents the length of the mRNA and protein in Fig.A and B,and represents the position of the cis-element in the promoter region in Fig.CFig.1 SlGRAS4 gene characteristic analysis

A.多序列比对；B.蛋白进化树，标尺表示遗传距离，数值表示从1 000次重复计算得到的 Bootstrap；C.保守基序图2 SlGRAS4蛋白同源性分析A.Multiple sequence alignment;B.Protein homology tree,the scale represents the genetic distance,the value represents the percentage of Bootstrap obtained from 1 000 repetitions;C.Conserved motif;Fig.2 SlGRAS4 protein homology analysis

2.4 沉默SlGRAS4降低了番茄高温和ROS信号应答基因表达水平

为了揭示SlGRAS4转录因子调控番茄耐高温胁迫可能的分子机制，对高温和ROS信号应答基因的表达水平进行了检测。正常温度下，高温信号转导关键基因HsfA1a、HsfA1b和Hsp90表达量在VSlGRAS4和Ve植株中无显著性差异(图6，A-C)，高温处理后表达量显著上调。VSlGRAS4植株中的HsfA1b表达量在高温处理8 h时显著低于Ve植株(图6，B)，Hsp90表达量在高温处理4 h时显著低于Ve植株(图6，C)，这说明高温胁迫下SlGRAS4基因沉默影响了正常的高温信号转导。正常温度下，ROS信号转导相关基因ZAT10和ZAT12的表达量在VSlGRAS4和Ve植株中无显著性差异，在高温处理4和8 h时，ZAT10和ZAT12在VSlGRAS4植株中的表达量均显著低于Ve植株(图6，D、E)，这说明高温胁迫下SlGRAS4基因沉默影响正常的ROS信号转导。ROS清除酶编码基因(包括CuZnSOD、FeSOD、CAT、APX1和APX2)是ROS信号的主要应答基因，在正常温度下，这些基因表达量在VSlGRAS4和Ve植株中无显著性差异。CuZnSOD、FeSOD、CAT和APX2表达量于高温处理8 h内，在VSlGRAS4和Ve植株中不断上升，且在处理8 h时表现为VSlGRAS4植株显著低于Ve植株；在高温处理4 h时，APX1在VSlGRAS4植株中表达量显著低于Ve植株(图6，F-J)。说明高温胁迫下沉默SlGRAS4基因可以通过降低ROS清除酶编码基因的表达量来降低番茄耐热性。

VSlGRAS4.沉默SlGRAS4基因番茄植株；Ve.对照番茄植株(V-empty)；A.琼脂糖凝胶电泳鉴定(M.DL2000；1.PCR 扩增结果；2.大肠杆菌菌落PCR结果)；B.SlGRAS4基因qRT-PCR结果，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)图4 VSlGRAS4植株的鉴定VSlGRAS4.SlGRAS4-silencing tomato plants;Ve.Control plants (V-empty);A.Agarose gel electrophoresis identification(M.DL2000;1.PCR amplification results;2.E.coli colony PCR results);B.qRT-PCR qualitative analysis of SlGRAS4 gene,different letters are significant at 0.05 levelFig.4 Identification of VSlGRAS4 plants

VSlGRAS4.沉默SlGRAS4基因番茄植株；Ve.对照番茄植株(V-empty)；星号表示在Student’s t test检验中，Ve与VSlGRAS4的差异显著性，*代表P<0.05，**代表 P <0.01，***代表 P <0.001，下同图5 SlGRAS4对番茄耐高温(40 ℃/40 ℃，昼/夜)胁迫能力的影响VSlGRAS4.SlGRAS4-silencing tomato plants;Ve.Control plants (V-empty)；Asterisks indicate significant differences between VSlGRAS4 and Ve with Student’s t test,* represents P <0.05,** represents P <0.01,and *** represents P <0.001;the same as belowFig.5 Effects of SlGRAS4 silencing on tomato heat tolerance (40 ℃/40 ℃,day/night)

图6 高温和ROS信号应答基因的表达分析Fig.6 Expression levels of response genes involved in heat and ROS signaling

3 讨 论

3.1 SlGRAS4参与番茄对逆境胁迫的响应

前人研究表明，SlGRAS4和AtSCL14属于GRAS基因家族中SCL9亚家族分支成员[20]，过表达AtSCL14通过增强β-CCA介导的保护性逆行反应降低有毒过氧化物和羰基化合物的水平，提高拟南芥对干旱胁迫耐受性，降低嫩叶组织对高光胁迫的敏感性[30-31]。序列比对和进化树分析发现SlGRAS4与AtSCL14具有相同保守基序和较近亲缘关系，这表明SlGRAS4可能具有与AtSCL14相似参与调控干旱和高光胁迫的生物功能。研究表明转录因子在响应不同胁迫时具有显著的重叠和交叉性[32]。本研究中，在高温和低温胁迫以及ABA和SA激素处理下，SlGRAS4同时被显著诱导表达，而干旱和盐胁迫处理下，SlGRAS4被显著诱导表达则发生在之后，并且本研究中在SlGRAS4启动子区域预测到ABA和SA响应元件，推测SlGRAS4可能通过ABA和SA依赖型胁迫应答途径交叉响应4种逆境胁迫，此外，SlGRAS4可能还通过其他途径参与番茄对温度胁迫的响应。这些结果均表明SlGRAS4参与番茄对逆境胁迫响应。

3.2 SlGRAS4可以提高番茄耐高温胁迫能力

Huang等[20]和牛义岭等[22]通过全基因组分析均在番茄中鉴定出53个SlGRAS转录因子，并分析了这些转录因子的基因与蛋白结构、进化关系以及在番茄不同组织和非生物胁迫处理下的表达模式。其中，Huang等[20]发现53个SlGRAS基因中有30 个在高温胁迫下显著诱导表达，且SlGRAS4在高温处理下的表达量较高，相比对照上调了30倍。本实验室通过转录组测序也发现SlGRAS4在高温胁迫下显著上调表达，但SlGRAS成员均未做耐热功能鉴定。因此，本研究选取对高温胁迫较为敏感的SlGRAS4利用VIGS技术进行耐热功能鉴定。本研究发现VSlGRAS4植株相对于Ve植株在高温胁迫下更容易萎蔫，Fv/Fm以及SOD和POD抗氧化酶活性显著降低，REL和H2O2含量显著升高，这说明在高温胁迫下沉默SlGRAS4使番茄植株细胞膜氧化损伤加重，光合能力降低，ROS清除酶活性减弱。前人研究表明VaPAT1拟南芥转基因株系在盐胁迫下的黄化程度和干旱胁迫下的萎蔫程度均显著轻于野生型株系[18]。转ZmSCL7烟草在盐胁迫下与对照相比Fv/Fm和叶绿素含量上升，丙二醛含量下降[33]。过表达SlGRAS7番茄株系在干旱和盐胁迫下的SOD、CAT和APX 活性显著高于野生型株系[23]。过表达VaPAT1拟南芥株系在盐和干旱胁迫下POD活性显著高于野生型株系[18]。这与本研究结果一致，说明SlGRAS4在高温胁迫下通过增强光合和抗氧化能力来提高番茄耐高温胁迫能力。

3.3 SlGRAS4可以通过调控高温和ROS应答基因表达来影响番茄耐热性

植物在高温胁迫下会激发体内的多个信号通路，这些信号应答基因形成复杂的调控网络来调控植物对高温胁迫耐受性。本研究VSlGRAS4植株中高温信号应答关键基因HsfA1b以及ROS信号应答基因ZAT10和ZAT12表达水平均显著低于Ve植株，表明SlGRAS4转录因子可以通过调控高温和ROS信号转导来影响番茄耐热性。ROS清除酶是热激响应性转录因子的靶基因，高温胁迫下植物通过转录因子来调节ROS清除酶编码基因的表达水平。研究表明，逆境胁迫下拟南芥中GRAS家族成员DELLAs通过提高ROS去氧化酶编码基因CuZnSOD和FeSOD的表达，使ROS处于较低水平，延缓细胞死亡[34]。过表达OsGRAS23水稻株系在干旱胁迫下POD和GST表达量相对于野生株系显著上调[17]。过表达SlGRAS40番茄株系在干旱和盐胁迫下ROS清除酶编码基因APX、CAT、SOD、POD表达量均显著高于野生型株系[23]。前人通过ChIP-seq和酵母单杂实验证明ROS清除酶包括POD、APX和谷胱甘肽转移酶(GST)编码基因是番茄SlGRAS4转录因子的靶基因，它们的启动子被SlGRAS4高度激活[35]。本研究检测了ROS清除酶编码基因的表达量，发现VSlGRAS4植株中CuZnSOD、FeSOD、APX1、APX2、CAT表达量显著低于Ve植株，说明SlGRAS4转录因子可以通过提高ROS清除酶编码基因的表达来增强番茄耐热性。

本研究为了解GRAS类转录因子特征和功能提供信息，同时对研究番茄耐热遗传育种有重要的理论意义。目前通过VIGS仅证明了SlGRAS4正向调控番茄耐高温胁迫响应，然而SlGRAS4是否依赖激素信号转导途径，以及与高温和ROS信号转导间的联系都不清楚，因此后续将深入研究SlGRAS4耐高温胁迫调控机制。