沙棘HrTCP转录因子家族鉴定及其干旱胁迫下的表达分析

姚 莹，王 伟，孙永媛，曹金锋，魏建荣，刘建凤*

(1 河北大学 生命科学学院，生命科学与绿色发展研究院，河北保定 071002；2 沧州市农林科学院，河北省农作物耐盐碱评价与遗传改良重点实验室，河北沧州 061001)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡颓子科、沙棘属落叶性灌木或小乔木，其具有耐旱、抗风沙、适应性强的特性，可在盐碱化或各种恶劣环境下生长良好[1-2]，其根系可有效降低水土流失、改善土壤理化性质[3-4]。此外，沙棘果实、茎和叶等各器官均含有丰富的营养物质和活性物质，尤其果实中含有大量的维生素C，被称为“维生素C之王”[5-6]。因此，沙棘已发展为中国重要的经济兼生态型树种，被广泛应用于黄土高原植被造林中。目前诸多学者致力于沙棘果实营养价值的开发和利用，但对沙棘自身的抗旱特性研究较少，尤其是响应干旱胁迫的分子机制更是鲜见报道。

TCP蛋白是植物特有转录因子家族之一，参与植物的生长发育与逆境响应的调节过程，其家族成员已在不同物种中被陆续鉴定与验证。TCP基因家族成员均含有一个由59个残基组成的碱性螺旋-环-螺旋(b-HLH)保守TCP 结构域[7]。在植物进化过程中该基因家族被分为两类TCP，Ⅰ类(GNCCC)成员也被称为PCF亚家族，而Ⅱ类成员被进一步细分为CIN和CYC/TB1亚家族[8-9]。现已从番茄(Solanumlycopersicum)、西瓜(Citrulluslanatus)和油菜(Brassicanapus)中分别分离到30、27和39个TCP转录因子[10-12]。在不同棉花品种中的TCP转录因子家族也随基因组测序的完成相继被鉴定并表达[13]。近年来发现TCP转录因子除了在植物发育过程中对细胞增殖和侧生器官发挥作用外[14-15]，它们还能通过激素信号传导等过程参与逆境胁迫应答。如过表达OsTCP19后可调节ABI4介导的途径提高水稻(Oryzasativa)抵御干旱胁迫的能力[16]；在草莓(Fragariavesca)中发现，FvTCPs基因家族成员受脱落酸诱导并在干旱胁迫下差异表达[17]；基于大豆(Glycinemax)干旱胁迫处理下鉴定的差异表达基因，共鉴定了147个转录因子，其中发现大豆中GmTCP4转录因子通过调节脱落酸和乙烯等植物激素信号，来提高大豆对干旱胁迫的响应能力[18]；此外，在干旱条件下，玉米(Zeamays)不同组织中发现有46个ZmTCP基因均参与了玉米植株对干旱胁迫的响应，其中ZmTCP42过表达导致种子萌发时对ABA产生超敏反应，增强了玉米植株抗旱性[19]。由此可见，TCP转录因子基因家族在介导植物抵御非生物胁迫中发挥着重要作用。

综上，本研究基于实验室前期沙棘转录组数据(PRJNA507906)[20]，获得沙棘HrTCP转录因子基因家族序列，利用生物信息学分析方法对沙棘HrTCP转录因子家族成员进行鉴定，并进一步通过qRT-PCR技术分析了关键转录因子成员在干旱、高盐胁迫及激素诱导下的表达情况，为明确沙棘HrTCP转录因子介导激素信号通路参与抗旱的作用机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 沙棘植株

实验材料为2～3年生沙棘扦插苗，种植于河北大学实验基地。该沙棘原始母株是由蒙古沙棘的实生无性系乌兰格木(Hippophaerhamnoidessubsp.mongolica，母本)与中国沙棘(HippophaerhamnoidesL.subsp.sinensis，父本)杂交获得的F2代无性系，取自于内蒙古磴口县中国林业科学研究院沙漠林业实验中心(40°25.935′N，106°43.442′E)。

1.2 方 法

1.2.1 沙棘HrTCP转录因子成员预测从NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gav/)分别获得拟南芥(Arabidopsisthaliana)、枣(Ziziphusjujuba)和水稻(Oryzasativa)各12个TCP转录因子氨基酸序列。从沙棘转录组数据获得22个TCP转录因子序列，利用SMART在线软件对TCP蛋白进行功能结构的预测，去除重复序列和不含TCP保守结构域的蛋白，以枣的TCP成员作为参考对照获得含有完整开放阅读框的11个沙棘TCP转录因子家族成员，命名为HrTCP2/4/7/8/11/13/15/17/18/19/20。利用ExPASy Proteomics Server (http://expasy.org/)预测所有沙棘HrTCP蛋白的分子量和等电点。

1.2.2 沙棘HrTCP家族的生物信息学利用MEGA6.0软件，通过Muscle进行序列比对，对上述沙棘11条HrTCPs的氨基酸序列，采用邻接法(neighbor-joining,NJ)及默认参数，校验参数Bootstrap重复500次，构建系统进化树。利用PlantTFDB edu.cn/)进行同源比对。利用DNAMAN软件对沙棘HrTCP蛋白进行序列比对。在GSDS2.0在线软件上(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)对沙棘TCP转录因子家族进行基因结构分析。用MEME (http:// meme.nbcz.net/meme/)分析沙棘TCP蛋白的保守基序。

1.2.3 沙棘HrTCP转录因子家族基因的表达分析选取生长一致的沙棘扦插植株(株高为1.2～1.5 m)，进行以下处理：200 mmol/L NaCl溶液和15% PEG-6000溶液分别均匀喷施在枝条上，于处理后0、1、12和48 h取样；0.1 mmol/L MeJA溶液和0.1 mmol/L ABA溶液分别均匀喷施在枝条上，于处理后0、1、6和12 h取样。以上处理均取植株地上部10、70和140 cm处叶片3片混合取样，3次独立重复，液氮冷冻后-80 ℃保存。

利用宝生物工程(大连)有限公司的植物总RNA提取试剂盒RNAiso Kit (D326S)提取沙棘叶片的总RNA，并采用UEIris II RT-PCR system for First-Strand cDNA Synthesis (with dsDNase)试剂盒(R2028,US EverbrightInc.)，以总RNA为模板反转录合成cDNA。以沙棘泛素基因(HrUbi)为内参基因，使用荧光定量PCR试剂盒(2×Fast Super EvaGreen qPCR Master Mix)进行HrTCPs的基因表达量分析，引物序列信息见表1。qRT-PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 20 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35 个循环，95→65 ℃熔解曲线(0.1 ℃/s)。采用2-ΔΔCt法进行数据分析。

表1 沙棘HrTCPs转录因子家族成员定量引物序列Table1 The fluorescent quantitative primers for HrTCP4/7/19/20 and HrUbi

2 结果与分析

2.1 沙棘HrTCPs转录因子家族成员序列特征分析

基于沙棘TCP基因家族转录组数据，得到22条沙棘HrTCP转录本信息(表2)，进一步对转录本序列筛选获得含有完整ORF框的TCP序列，并以枣的TCP基因家族成员信息为参考，最终获得11条沙棘HrTCP转录因子家族序列(表3)。

表2 基于转录数据获得沙棘TCP转录因子家族序列Table 2 The sequences of TCP transcription factors based on Hippophae rhamnoides transcriptional data

通过分析发现该家族的11个成员氨基酸序列长度介于218～590之间，编码蛋白质的相对分子量介于23.44～61.78 kD之间，其中分子量最大的是HrTCP8，最小的是HrTCP11。蛋白质的等电点范围为6.09～9.72，其中最大为HrTCP7，最小为HrTCP19。此外，对蛋白质的亚细胞定位进行预测，结果表明除了HrTCP13/17/18的定位于细胞质，其余8条均在细胞核(表3)。

表3 沙棘HrTCP基因家族成员序列特征Table 3 Characterization of H.rhamnoides HrTCP gene family

2.2 沙棘HrTCP转录因子家族成员进化树分析

将沙棘11个HrTCP蛋白与拟南芥、水稻和枣TCP蛋白进行系统进化树分析。结果显示，沙棘TCP家族成员可分类为I亚族(PCF亚家族：HrTCP7/8/11/15/19/20)和II亚族(CIN亚族：HrTCP2/4/13/17/18)，同时发现沙棘、水稻、枣和拟南芥TCP家族基因呈现明显的聚类现象。此外，沙棘的每一条HrTCP序列都有与其较高相似度的其他物种序列，如HrTCP20与AtTCP20，HrTCP15与ZjTCP15、OsTCP14，HrTCP17与ZjTCP5等。推测沙棘TCP基因可能与同一分支上其他物种的同源基因具有相似的生物学功能(图1)。

Hr.沙棘;Os.水稻;At.拟南芥;Zj.枣图1 沙棘与其他物种TCP转录因子家族进化分析Hr.Hippophae rhamnoides;Os.Oryza sativa;At.Arabidopsis thaliana;Zj.Ziziphus jujubaFig.1 A neighbor-joining phylogenetic analysis of TCP transcription factor family in HrTCPs and other plants

2.3 沙棘HrTCP蛋白的保守区域比对

对预测的11个HrTCP转录因子的结构域进行分析表明，11个沙棘TCP蛋白均含有一个结合DNA和蛋白互作所必需的TCP结构域，即bHLH结构域，且该结构域参与DNA结合及其二聚化，保守程度高，其碱性区域位于bHLH结构域的N端，PCF亚族成员(HrTCP7/8/11/15/19/20)在基本区域(Basic)缺少4个氨基酸，但均不缺少双螺旋区的氨基酸(图2)。

图2 沙棘TCP蛋白保守结构域比对Fig.2 Alignment of conserved domains of TCP proteins in H.rhamnoides

2.4 沙棘HrTCPX家族蛋白保守基序分析

基于MEME等软件分析11个沙棘HrTCP家族成员，绘制HrTCP家族成员单独构建的系统进化树、序列结构及保守基序信息图谱(图3)。HrTCP基因家族单独构建的进化树与之前一致，总体上分为PCF亚族和CIN亚族。基因结构分析表明TCP家族11个成员均含有一个外显子和上/下游结构，但不同成员他们的外显子的长度及位置具有一定差异。共选取10个motif，并将保守基序分别命名为motif1-motif10。在HrTCP蛋白中每个蛋白均含有不同数量、不同种类的motif，11个蛋白可能含有各自不同的功能特性。其中motif1、motif2和motif3比较典型，motif1存在于所有成员中，motif2仅存在于PCF亚族成员中，motif3仅存在于CIN亚族成员中。HrTCP4和HrTCP7蛋白只含有2个motif；HrTCP15和HrTCP11蛋白含有3个motif；HrTCP19和HrTCP20蛋白含有4个motif；HrTCP8、HrTCP13和HrTCP2蛋白含有5个motif；HrTCP17和HrTCP18蛋白含有6个motif，所含motif数量最多。通过进一步的分析发现，11个HrTCP 蛋白均包含的motif1与TCP蛋白的bHLH结构域序列高度一致。PCF亚族成员中motif1和motif2关联，CIN家族成员的motif1和motif3关联。其他motif只在某些TCP蛋白中出现，且无规律性。对每个结构域进行分析发现，motif1含有50个氨基酸且保守性较高。

图3 沙棘HrTCP转录因子家族结构及基序分析Fig.3 Analysis of gene structure and motif of TCP transcription factor family in H.rhamnoides

2.5 参与沙棘抗旱的HrTCPs候选基因筛选

为了进一筛选沙棘中参与抗旱的关键基因，我们将沙棘TCP家族11个成员与其他物种参与抗旱的TCP成员进行聚类分析，发现HrTCP4、HrTCP7、HrTCP19和HrTCP20分别于FmTCP4、BpTCP7、OsTCP19和AtTCP20高度同源(图4)。由此推测HrTCP4/7/19/20可能也具有调控沙棘抵御干旱胁迫的生物学功能。

Hr.沙棘;Os.水稻;At.拟南芥;Bp.白桦;Fm.水曲柳图4 响应沙棘干旱胁迫的HrTCPs基因筛选Hr.Hippophae rhamnoides;Os.Oryza sativa;At.Arabidopsis thaliana;Bp.Betula platyphylla;Fm.Fraxinus mandshuricaFig.4 The selection of the genes which have responses to drought stress

2.6 干旱和盐胁迫下HrTCPs的表达分析

本研究采用实时荧光定量qRT-PCR方法，对HrTCP4/7/19/20的表达量进行分析。由图5可以看出，在PEG处理1 h后HrTCP7/19/20基因表达量分别是对照组表达量的2倍、22倍和24倍，在处理12 h后表达量降低。由此可见，沙棘受到干旱胁迫后HrTCP4/7/19/20的表达量会发生明显的上调变化，其中HrTCP20反应最为强烈；在NaCl处理后，HrTCP4/7表达量整体呈下降趋势，而HrTCP19/20呈上升趋势并在12 h达到峰值，其中HrTCP20表达量上升达到极显著水平。

2.7 激素处理后HrTCPs基因的表达分析

本研究对ABA和MeJA处理后沙棘HrTCP4/7/19/20的表达量分析发现，ABA处理后，HrTCP4/7/19/20基因在不同处理时期表达量有极大的差异(图6)。HrTCP4转录因子表达量下调且变化不显著，HrTCP7/19/20转录因子对ABA处理反应较为敏感，在处理1 h后表达量最高，分别是对照实验组的5倍、16倍和12倍，其中HrTCP19对ABA处理的反应最为强烈。MeJA处理后，HrTCP4表达量先上升后趋于平稳，而HrTCP7/19/20表达量升高较为显著，其中HrTCP20对MeJA处理的表达量升高达到极显著水平，在处理1 h表达量最高，是对照组表达量的5倍左右。结果表明，HrTCP7/19/20受ABA诱导，HrTCP4/7/19/20受MeJA诱导(图6)。

*和**分别表示P<0.05、P<0.01；下同图5 非生物胁迫处理下沙棘HrTCP4/7/19/20基因表达分析* and ** mean P<0.05,P<0.01,the same as belowFig.5 Expression analysis of HrTCP4/7/19/20 in H.rhamnoides under abiotic stresses

图6 激素处理下沙棘HrTCP4/7/19/20基因表达分析Fig.6 Expression analysis of HrTCP4/7/19/20 in H.rhamnoides under hormone treatments

3 讨 论

目前，TCP转录因子家族已相继在拟南芥[21]、棉花[22]、番茄[23]、黄瓜[24]及苹果[25]等物种中获得并鉴定，发现该家族在植物生长发育及抵御逆境胁迫中具有重要调控作用。沙棘作为中国重要的经济兼生态型树种，其具有抗旱、耐盐等特性，但其TCP基因家族是否参与沙棘植株抵御逆境的响应还鲜见报道。鉴于此，本研究基于沙棘转录组数据，获得具有完整开放阅读框的11个TCP转录因子，该基因家族的成员数量相对较少，是否还有尚未发现的成员，有待进一步研究。同时发现沙棘HrTCP基因家族的11个成员，均含有b-HLH保守域、N-端碱性氨基酸区和 DNA识别和结合位点，这与DePaolo等的研究结果一致[26]，表明该基因家族的作用方式比较相似。HrTCP蛋白质的亚细胞定位预测，发现有8个蛋白定位于细胞核内，这与茶树和草莓中TCP家族成员分布情况类似[17,27]，进一步说明了其作为转录因子主要在细胞核内发挥调控功能。此外，对沙棘TCP转录因子家族进行系统进化树分析及基序分析发现不同成员含有不同基序，但同亚族的家族成员含有的基序较为一致，该结果与枣TCP基因家族基序分布情况较吻合[28]。由此，我们推测这些基序的存在可能与其相应基因发挥的生物学功能密切相关。

早期研究发现植物中茉莉酸信号突变体具有更好的耐旱性，拟南芥中一类TCPs中AtTCP20可以通过与LOX2启动子结合调控茉莉酸途径[29]；水稻OsTCP19基因介导ABI4通路可以提高水稻苗期和成熟期干旱胁迫耐受性[15]；木本植物水曲柳中FmTCP4 响应了寒冷、盐与干旱等非生物胁迫以及激素信号的诱导[30]；白桦BpTCP7基因启动子序列含有干旱与低温响应元件，其在响应干旱和低温应答过程中起正调控作用[31]。鉴于此，本研究将水稻、水曲柳和白桦中参与抗旱功能的TCP基因与沙棘HrTCPs转录因子家族成员进行聚类分析，获得具同源一致性较高的4个关键基因(HrTCP4/7/19/20)，推测沙棘中这几个关键基因可能在干旱胁迫响应中也发挥重要作用。

本研究利用qRT-PCR分析发现，PEG处理条件下，HrTCP4/7/19/20基因的表达量明显上调，HrTCP20反应最为强烈；NaCl处理条件下，HrTCP19/20表达量上调，而HrTCP4/7的表达量呈下调趋势，该结果与水稻、水曲柳和白桦树种等物种中TCP参与抗旱的功能结果一致。本研究中导致HrTCPs基因表达上调的原因可能是由于干旱和盐胁迫均能对植物产生一定的渗透作用，从而诱导了基因不同程度的表达，但是盐胁迫过程中会产生离子毒害等现象，从而引起基因在盐胁迫和干旱胁迫下的表达趋势不同[32]。此外，ABA和JA信号通路在植物响应干旱胁迫中起着重要作用，非生物胁迫的发生会迅速激活植物体内ABA和JA激素信号通路，使相关基因的转录水平发生变化[33]。本研究荧光定量结果显示，HrTCP4/7/19/20均受到脱落酸和茉莉酸甲酯激素的诱导，该结果与毛竹TCP转录因子成员介导ABA信号通路响应干旱胁迫结果一致[34]。另有研究发现拟南芥中miR319靶向的TCP结合LOX2启动子并激活脂氧合酶的活性，促进JA的生物合成[35]。综上，TCP转录因子家族成员可以参与相关激素的合成来抵御干旱胁迫，本研究结果进一步表明HrTCP4/7/19/20可能在ABA和JA激素介导的干旱胁迫响应中起正调控作用。这些现象为深入解析HrTCP转录因子家族的抗旱分子机制提供新的方向。

本研究首次鉴定了沙棘HrTCP转录因子家族结构特征，并对该基因家族在干旱、盐胁迫及激素ABA与JA诱导下的表达模式进行初步分析，发现HrTCPs转录因子与非生物胁迫和激素诱导密切相关，尤其沙棘转录因子HrTCP20基因是调控沙棘抗旱的关键基因，该研究结果为解析沙棘抗逆性分子机制提供理论基础，同时也为进一步培育沙棘抗逆性品种提供重要的基因资源。