硝态氮与无机磷浓度及其比例对簇生舟形藻生长生理及细胞形态的影响

陈 宁，何佳昕，孙晓莉，刘 妍，范亚文

(哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院，黑龙江省水生生物多样性研究重点实验室，哈尔滨 150025)

硅藻作为常见的淡水藻类，其密度与水体的营养水平密切相关[9-10]，其主要依靠水中的氮、磷元素进行繁殖，水体中氮、磷的浓度以及氮磷比都能对硅藻的种类及丰度产生重要的影响，因此硅藻常可作为水体检测的指示性植物[11-12]。早在2007年Ponader等[13]就通过对新泽西河流水体环境的研究发现，水系中硅藻可以作为监测和评估水体中氮、磷浓度的一项常规指标。淡水浮游硅藻最适氮磷比为7.3∶1，此时浮游硅藻的生长和繁殖速度最快，当氮、磷浓度增加时，会影响藻类的叶绿素、蛋白质含量以及SOD活性等多种生理指标[14]。簇生舟形藻是一种典型的普生性淡水单细胞硅藻，具有个体小、生长速度快并对环境污染物高度敏感等特性，因此对于水环境中富营养化有比较明显且直观的理化反应，能够较好地反映水体的营养状态及水环境变化情况[9]。

目前，水体中氮、磷含量与硅藻相关性的研究多集中于氮、磷含量对硅藻生物量的影响及硅藻对于氮、磷降解等方面，而关于淡水硅藻对富营养化水体不同氮、磷浓度的生理指标响应及形态学变化的研究相对较少。本研究模拟了“仿生”硝态氮和无机磷污染环境，探究不同浓度、不同胁迫时间及不同氮磷比条件下簇生舟形藻对氮磷胁迫的生长、生理及形态的响应特征，从而研究簇生舟形藻对于过高浓度营养盐的利用状况，为利用簇生舟形藻指示水体中氮、磷富营养化水平提供理论基础，这对探究硅藻对水环境中氮磷胁迫的响应机制及其对水环境监测的指示作用都具有重要的意义。

1 材料和方法

1.1 藻种的培养

簇生舟形藻由哈尔滨师范大学水生生物实验室采集并分离纯化，并将分离纯化后的簇生舟形藻转接至WC改良培养基中进行培养。在无菌条件下，挑选生长良好的纯种藻株放入恒温培养箱中进行逐级扩大培养，培养温度为(20±1)℃，光照条件为4 000 lx，光/暗时间为12 h/12 h，每天对藻液定时摇动3～5次，防止藻体在瓶壁附着成块，培养10～15 d，达到对数生长期，用于后续实验。

1.2 氮、磷胁迫实验

依照文献记载[15-17]和前期预实验结果，采用不同浓度梯度的硝酸钠(NaNO3)和磷酸二氢钾(KH2PO4)对簇生舟形藻分别进行单一氮、磷浓度以及氮磷配比3组胁迫处理，每组各设置5个水平，氮胁迫浓度分别为0.5、5.0、50、250和500 mg·L-1(NO3--N)，磷胁迫浓度分别为0.05、0.5、1、5和25 mg·L-1(H2PO4--P)，氮磷浓度配比分别为5∶1、10∶1、20∶1、50∶1和100∶1。实验藻种的初始细胞密度为1×104cell·mL-1。每个实验组设3次重复，将藻株放入WC培养基中，置于20 ℃恒温培养箱中培养，光照条件为4 000 lx，光/暗时间为12 h/12 h，分别在处理1、3、5、7、9、11、和13天时取样进行相关指标的测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 细胞密度依照设定浓度胁迫后，采用分光光度法与血球计数法相结合的方法对簇生舟形藻进行细胞数量统计，用细胞个数与透光率(OD680)之间的线性回归方程计算细胞密度。回归方程为C= -0.101 4x+ 98.522(R2=0.999 4)，式中C代表细胞密度(×104cell·mL-1)，x代表OD680值。取2 mL处理后的藻液，混匀，在680 nm波长下测定透光率(以纯净的WC改良培养基调零)，按上述回归方程计算出相应的细胞密度并绘制生长曲线。对处理13 d后的簇生舟形藻进行比生长速率测定，比生长速率(μ)计算公式如下：μ= (lnXt-lnX0)/t

式中，X0表示初始藻细胞量，Xt表示t天后的藻细胞量

1.3.2 叶绿素a含量采用丙酮萃取法测定细胞中的叶绿素含量[18]。取不同浓度氮、磷及其配比胁迫后的均匀藻液10 mL置于离心管中，5 000 r·min-1离心10 min，弃上清液，加入5 mL 80%丙酮，超声破碎30 min，于4 ℃冰箱中避光提取24 h，4 ℃、5 000 r·min-1离心10 min，取上清液，分别在663 nm和646 nm波长下测定其吸光度A663和A646(以80%丙酮调零)。根据以下公式计算叶绿素a(Ca)含量：

Ca=12.21A663-2.81A646

1.3.3 丙二醛含量采用TBA法测定细胞内丙二醛含量[19]。取5 mL不同浓度氮、磷及其配比胁迫后的藻液，3 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，用液氮研磨至粉末状，加入3 mL的10%三氯乙酸，离心5 min，上清液即为酶液。取2 mL待测酶液和2 mL的0.6%硫代巴比妥酸溶液，混匀，于沸水浴中反应30 min，迅速冷却并离心，取上清液分别于450、532及600 nm波长下测定其吸光度A450、A532和A600。取2 mL硫代巴比妥酸和2 mL三氯乙酸混匀，作为对照管进行调零，按以下公式进行计算丙二醛含量(CMDA)：

CMDA(μmol·L-1)=6.45(A532-A600)-0.56A450

1.3.4 蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定细胞内的蛋白质含量[20]。取5 mL不同浓度氮、磷及其配比胁迫后的藻液，3 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，用液氮研磨沉淀至粉末状，加入1.5 mL的磷酸缓冲液，离心5 min，上清液即为粗酶液。分别取1 mL由不同实验组藻液提取得到的粗酶液，加入染料溶液5 mL混匀，5 min后在595 nm波长处测定吸光值A595，对照标准曲线求得蛋白质浓度。

1.3.5 超氧化物歧化酶活性采用氮蓝四唑光还原法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性[21]。取5 mL不同浓度氮、磷及其配比胁迫后的藻液，3 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，用液氮研磨沉淀至粉末状，加入1.5 mL的磷酸缓冲液，离心5 min，取上清液。并且设置调零管和测定管置于暗处反应10 min，最大光还原管置于25 ℃恒温光照培养箱中反应10 min，于560 nm波长下测定吸光度A560。用以下公式进行计算SOD活性(以鲜重表示)：

SOD活性(U·g-1)=(A空-A测)V总/(0.5A空WV反)

式中：A空为最大光还原管的吸光值，A测为测定管的吸光值，V总为提取液总体积(mL)，W为样品鲜重(mg)，V反为反应时添加的酶液体积(mL)。

1.3.6 过氧化氢酶活性过氧化氢酶(CAT)活性采用钼酸铵法[22]测定。取5 mL不同浓度氮、磷及其配比胁迫后的藻液，3 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，用液氮研磨沉淀至粉末状，加入1.5 mL的磷酸缓冲液，离心5 min，上清液即为粗酶液。取上清液0.2 mL与1.0 mL的基质液一起置于37 ℃水浴箱中水浴60 s，加32.4 mmol·L-1铝钼酸铵1.0 m L，混合后于室温放置5 min，在405nm处用空白调零，测定样品组(包括1.0 mL基质，1.0 mL钼酸铵试剂，0.2 mL上清液)和空白组(包括1.2 mL缓冲液和1.0 mL钼酸铵试剂)的吸光度值A和A0。CAT活性(以蛋白质含量表示)计算公式如下:

CAT活性(U·mg-1)= (A0-A)×271/(1/60×V×C)

式中：A0为空白管的吸光度值，A为测量管的吸光度值，V为反应中加入酶溶液的体积，C为样品的蛋白浓度。

式中，Na为形态发生畸变的细胞数，N0为细胞的总体数量

1.4 数据处理

实验数据图采用Origin绘制，方差分析利用One-way ANOVA进行分析，多重比较采用LSD法进行。所有的数据分析都在SPSS 25.0软件中进行，差异显著性水平为0.05(P<0.05)和0.01(P<0.01)。

2 结果与分析

2.1 氮、磷施用浓度及比例对簇生舟形藻生长的影响

2.2 氮、磷施用浓度及比例对簇生舟形藻叶绿素a和蛋白质含量的影响

不同小写字母表示处理间在0.05水平存在显著性差异，下同。图1 不同氮、磷施用浓度及比值下簇生舟形藻细胞密度和比生长率的变化The different normal letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level;the same as belowFig.1 Changes of algal cell density and specific growth rate under different N and P concentrations and N/P ratios stress

图2 不同氮、磷施用浓度及比例下簇生舟形藻叶绿素a和蛋白含量的变化Fig.2 Changes of Chl a and protein contents in algal cell under different N and P concentrations and N/P ratios

2.3 氮、磷施用浓度及比例对簇生舟形藻丙二醛(MDA)含量的影响

图3 不同氮、磷施用浓度及其比例处理下簇生舟形藻丙二醛含量的变化Fig.3 Changes of MDA content in algal cell under different N and P concentrations and N/P ratios

2.4 氮、磷施用浓度和比例对簇生舟形藻SOD和CAT活性的影响

图4 不同氮、磷施用浓度和比例下簇生舟形藻的SOD和CAT活性的变化Fig.4 Changes of SOD and CAT activities in algal cell under different N and P concentrations and N/P ratios

2.5 氮、磷施用浓度对簇生舟形藻形态特征及畸形率的影响

3 讨 论

A-F.光学显微镜观察：A-C.对照；处理；处理；F.N∶P(100∶1)处理；G-Q.扫描电子显微镜观察：G、H.对照；处理；处理；O-Q.N∶P(100∶1)处理图5 高浓度氮(500 mg·L-1)、磷(25 mg·L-1)和氮磷比(100∶1)胁迫前后簇生舟形藻细胞的形态变化A-F.Optical microscope：A-C.Control;D. mg·L-1) treatment;E. mg·L-1) treatment;F.N∶P(100∶1) treatment;G-Q.Scanning electron microscope：G,H.Control;I-K. mg·L-1) treatment;L-N. mg·L-1) treatment;O-Q.N∶P(100∶1) treatmentFig.5 Morphological changes of algal cells under high concentrations of N (500 mg·L-1),P (25 mg·L-1) and N∶P(100∶1)

光合作用是藻类最基本和最重要的生命活动过程，叶绿素含量的变化可以直接反映出藻类光合作用能力的强弱，同时叶绿素的含量也是藻类受环境胁迫的重要生理指标之一。本研究结果表明高浓度氮、磷胁迫对簇生舟形藻的叶绿素a有一定的抑制作用，氮处理时间的延长促进了藻类细胞的生长和生物量的积累，这与Song等[29]的研究结果相似。叶绿素a可以降低由胁迫产生的活性氧基团(ROS)导致的细胞损伤[30-31]，其含量变化可能是由于叶绿素a对胁迫引起的细胞内ROS的积累能快速反应。长时间的磷胁迫使藻细胞自身调节能力减弱，同时，磷还能破坏其细胞内叶绿体的合成，阻碍光合作用，最终导致细胞中叶绿素a含量的降低[32]，而这种变化也与细胞密度的变化趋势基本一致。蛋白质是藻细胞维持正常生理功能的物质保障[23]，通常情况下，当营养盐供应充足时藻类体内蛋白质的合成量增加。但在本研究表明长期的高浓度富营养环境能影响簇生舟形藻的生理过程并抑制它们的正常生长。这与程丽巍等[33]对几种藻类的研究结果一致，氮、磷含量对不同藻类体内总蛋白含量的影响存在着一定的差异。在氮磷比为5∶1时叶绿素a和蛋白质含量显著降低，氮限制能够显著抑制三角褐指藻的生长速率与光合活性，叶绿素a含量较氮充足时降低了73%[34]。在本研究表明过高或过低的氮磷比均不利于簇生舟形藻的生长并可能抑制其光合作用。对簇生舟形藻而言氮磷比高于50∶1为磷限制；氮磷比低于50∶1为氮限制，无论氮限制还是磷限制，其叶绿素a和蛋白质含量均明显低于氮磷比为50∶1的处理组。本研究还发现氮对簇生舟形藻生长和生理状态的影响高于磷，这与王敏等[35]的研究结论一致。

MDA是膜脂质过氧化的重要标志之一，其含量能反映细胞受活性氧的毒害程度[36-37]。在李雪琴等对蛋白核小球藻的研究中发现，低浓度有机磷农药胁迫下其体内MDA含量升高，而高浓度下MDA含量降低[38]。这与本研究结果相似，足以表明在短时间氮、磷及氮磷比胁迫下藻类具有一定的抗逆性和适应性，但随着胁迫时间和胁迫浓度的增加，会使藻类细胞损伤严重进而导致其抗逆机制被破坏。超氧化物歧化酶(SOD)是细胞中活性氧清除系统中重要的抗氧化酶，它能使细胞中过量的ROS转化为H2O和O2，减轻ROS对细胞的损伤[39]，过氧化氢酶(CAT)将H2O2进一步分解为H2O和O2。本研究发现氮、磷浓度及氮磷比的升高激发了簇生舟形藻细胞内的氧化应激反应，SOD和CAT酶活性的增加有助于舟形藻抵抗过量的营养盐造成的环境胁迫[29,36]。高浓度的氮、磷及氮磷比处理对簇生舟形藻有毒害作用，其原因可能是因为脂质过氧化损伤而导致，此时簇生舟形藻细胞可能处于极度应激状态，大量的过氧化物和超氧化物消耗了细胞内的碳水化合物使细胞受到了严重的氧化损伤。最初，细胞内的活性氧产生在SOD和CAT酶分解的正常范围内；因此，SOD和CAT酶活性随着酶底物浓度的增加而提高。当活性氧超过正常分解能力时，SOD和CAT酶活性降低，氧自由基浓度升高，对簇生舟形藻造成伤害。处理后期，活性氧的增加可能远远超过簇生舟形藻抗氧化酶系统的正常酶活性，导致植物体内氧化代谢失衡，SOD和CAT活性显著下降。这一结果与以前的研究[27,40]相似。Jorge和Stephan[41]的研究表明，氨能够产生氧化应激，表现CAT和POD活性增强，CAT酶活性增加与本研究结果较一致。

4 结 论

(3)模拟实验数据显示在环境氮、磷富营养化初期会出现藻类加速生长情况，但是长时间高浓度的氮、磷营养盐胁迫使硅藻中对细胞起到保护作用的主要生理指标含量或活性均被抑制，并将最终威胁到簇生舟形藻在水体境中的数量和群落结构，说明高浓度氮、磷富营养化对藻体产生了逆境毒害。因此，利用簇生舟形藻对水体中氮、磷富营养化的逆境响应现象可以指示水体营养盐过量程度，探索硅藻在过度营养水环境中的抗逆水平，还可为藻类对水环境的风险指示提供基础数据和实践依据。