神经病理性疼痛表达谱及核心基因的生物信息学分析*

李宗吉 朱佳佳 李 琳

1 宁夏医科大学基础医学院，宁夏银川市 750004；2 宁夏医科大学医学科学技术中心；3 宁夏回族自治区人民医院

慢性痛越来越成为危害人类身心健康的重要疾病。据相关研究统计，美国约有1.16亿成年人遭受慢性痛的折磨，每年花费在慢性痛上的医疗费用远远超出心血管疾病、癌症和糖尿病三种疾病的总花费，在欧洲每5人就有1人患慢性痛[1-3]。神经病理性疼痛是临床最常见的慢性疼痛，是指由于传入神经、脊髓或中枢神经系统等部位受到损伤而引起的疼痛综合征，多呈难治性，可伴发睡眠障碍、焦虑、抑郁等神经精神疾病，使患者的身心健康及生活质量受到极大影响[4-6]。神经痛的发病机制十分复杂，虽然大量文献报道免疫、神经递质、离子通道等参与神经痛的发生、发展的过程，但发病分子机制并不清楚，临床仍然缺乏理想的治疗药物[7-9]。因此，深入研究神经病理性痛的发病机制具有重要的理论及现实意义。

近几十年来，随着高通量测序技术、微阵列芯片技术以及生物信息学技术的快速发展，使研究人员能够更系统全面地开展疾病相关生物学机制的研究，更有效地确定影响疾病发生、发展、治疗和预后的关键分子。在本研究中，我们从基因表达综合数据库中检索神经病理性疼痛模型小鼠的芯片检测数据。随后分析鉴定了一系列差异表达基因，进一步通过生物信息学技术综合分析神经病理性疼痛模型小鼠差异表达基因。本研究旨在为神经病理性疼痛提供新的治疗靶点和早期诊断标志物，并帮助理解神经性疼痛潜在的神经病理机制。

1 材料和方法

1.1 数据集获取 在美国国立生物中心(NCBI)的 GEO 数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)检索并下载神经病理性疼痛mRNA 表达谱芯片数据集GSE89224。该数据集含有9个手术处理的小鼠 (8～12周)和7个假手术对照组小鼠。手术组：小鼠行选择性神经损伤模型(Spared nerve injury,SNI)，胫神经和腓总神经用5.0丝结扎，远端切断，切除2～4mm远端神经残端，同时保留腓肠神经完整。假手术组坐骨神经暴露但未结扎。SNI 7d后，L4～5腰椎取损伤同侧脊髓背角神经结，进行总RNA提取。基因表达检测平台为GPL341(Affymetrix大鼠表达230A阵列)。

1.2 差异表达基因筛选 差异表达基因是通过GEO2R分析从GEO数据库中获得的芯片数据，校准后以P<0.05和|logFC|>2.0作为差异表达基因筛选准则。

1.3 差异表达基因生物信息学分析

1.3.1 分子功能及通路富集分析：将预测到的差异表达基因在DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)网站在线进行基因本体论(GO)富集分析，使用Enrichr在线工具(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)进行基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析。

1.3.2 蛋白互作网络(PPI)构建及核心基因筛选：在string(https://string-db.org/cgi/input.pl)网站在线进行靶基因间的蛋白互作分析；采用 Cytoscape3.6.0 软件对差异表达蛋白之间的互作关系进行网络分析，根据蛋白连接度筛选出调控作用网络中起关键作用的核心基因。

1.3.3 相关药物预测：在DGIdb数据库(http://dgidb.genome.wustl.edu/)中，预测靶向核心基因的治疗药物，预测结果在cytoscape3.6.0 中可视化。

2 结果

2.1 差异表达基因的鉴定 为确保分析结果的可靠性，我们首先进行数据背景校正和标准化(见图1)。然后，我们分析筛选发现了121个差异表达基因(120个上调，1个下调)，见表1。

图1 SNI实验组与假手术对照组基因表达值箱线图

表1 SNI小鼠差异表达基因

2.2 GO和KEGG信号通路富集分析 对差异表达基因进行GO功能分析和KEGG信号通路富集分析，GO分析包括生物学过程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)及细胞成分(Cell component，CC)。见表2。

2.3 蛋白互作网络分析(PPI Network) 在cytoscape中对121个分子进行互作关系可视化分析(见图2)，并依据分子间的连接度在PPI网络中筛选出10个核心调控基因。见图3。

2.4 hub基因—药物网络 在DGIdb基因—药物作用数据库中，筛查靶向hub调控基因的药物。黄色节点代表核心基因，绿色节点代表相关药物。网络中共有5个核心基因和16种这些基因的靶向药物。见图4。

3 讨论

本研究中，我们从GEO数据库下载神经病理性疼痛SNI模型小鼠和假手术对照组小鼠基因表达芯片检测数据集GSE89224，采用GEO2R筛选差异表达基因共121个，之后进一步生物信息学分析这些差异表达基因的生物学特性并从中构建蛋白互作网络，筛选出关键调控作用的核心基因。GO和KEGG富集分析的结果显示出这些分子的功能和富集通路都与免疫炎症相关，以往大量研究也表明，神经损伤后神经细胞免疫功能的激活是引起神经病理性疼痛的主要原因和重要机制之一[10-12]。

在筛选的hub基因中，Ctss、Rac2、Laptm5、Cd53、C1qb、Ptprc、Tyrobp、Csf1r、Ptpn6、Cd68分子在所有白细胞上都有表达，称为白细胞共同抗原(Leukocyte

表2 GO与KEGG富集分析结果

图2 121个差异表达基因的分子互作(PPI)网络图

图3 PPI网络中10个hub基因

图4 药物与核心基因作用网络

common antigen,LCA)。Ptpn6是细胞质中的重要磷酸酶，其最主要的功能是抑制自身免疫病以及IL-1受体依赖、caspase-1非依赖的自身炎症性疾病的发生，中性粒细胞中特异性删除Ptpn6会自发IL-1受体依赖的自身免疫性疾病，这说明Ptpn6会抑制IL-1产生和分泌，但是其中的具体机制还不清楚[13]。Tyrobp基因编码跨膜信号传导多肽，在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，编码的蛋白质可能与膜糖蛋白的杀伤细胞抑制受体(KIR)家族相关，并且可以充当激活信号转导元件，该蛋白可能与Zeta链(TCR)相关的蛋白激酶70kDa(ZAP-70)和脾酪氨酸激酶(SYK)结合，并在信号传导、骨骼建模、脑髓鞘形成和炎症中发挥作用，该基因内的突变与多囊性脂膜性骨质增生伴有硬化性白质脑病(PLOSL)有关，也被称为纳苏—哈科拉病。它的特定受体触发在髓样细胞2(TREM2)上表达的受体，也会引起PLOSL[14]。Rac2基因编码RAS超家族成员的鸟苷三磷酸(GTP)代谢蛋白，编码的蛋白质定位于质膜，在质膜上调节分泌、吞噬和细胞极化等多种过程。这种蛋白的活性也与活性氧的生成有关，该基因突变与中性粒细胞免疫缺陷综合征有关[15]。Cd68是巨噬细胞最可靠的标记，Cd68表达于以下细胞中：单核细胞、巨噬细胞、粒细胞嗜碱性粒细胞、大淋巴细胞、破骨细胞、肥大细胞[16]。

此外，4个基因(Cd68、Ctss、Laptm5、Cd53)参与了小胶质细胞的活动，多项研究表明激活的小胶质细胞是引发神经病理性疼痛的关键因素。Cd68是一种被广泛应用的生物标记物，用于检测活化的巨噬细胞或小胶质细胞，其过度表达代表巨噬细胞及小胶质细胞功能表型改变，促炎M1细胞直接诱发神经痛。Ctss和Laptm5都是小胶质细胞中溶酶体相关蛋白[17]。Ctss在维持神经病理性疼痛中的作用已被证实，而Laptm5在神经痛中的作用暂未明确[18]。神经损伤后，细胞表面黏附分子Cd53在小胶质细胞中表达升高，可能与神经损伤后细胞表面黏附分子介导小胶质细胞迁移有关。考虑到在神经病理性疼痛发生的中早期即有小胶质细胞的活化，所鉴定的5个基因有可能成为神经病理性疼痛的早期诊断生物标志物。小胶质细胞有两个不同的激活状态，其中M1促炎反应，而M2抑制炎症反应。M1小胶质细胞释放促炎或神经毒性因子诱导神经痛，而M2小胶质细胞释放抗炎因子抑制炎症，从而减轻神经痛。最近的研究表明，虽然M1和M2小胶质细胞在神经损伤后都被激活，但小胶质细胞随着神经痛的发展倾向于向M1表型发展。这个或许可以解释为什么抑制小胶质细胞的激活可以减轻神经痛，而可不管其表型如何[19-21]。因此，调节小胶质细胞极化，抑制M1型小胶质细胞反应，促进M2小胶质细胞的抗炎作用是神经性疼痛的一种有效治疗方法。GO和KEGG富集分析也显示差异表达基因主要集中在免疫系统，包括细胞与受体作用，FcrR介导吞噬、抗原处理和呈递，自然杀伤细胞介导的细胞毒作用，Th17细胞分化，T细胞受体信号通路等。这些分析结果为我们提供了神经痛发生发展的分子基础。

我们通过构建神经免疫相关基因的蛋白质互作网络，并筛选出核心调控基因，对这些分子的深入探索或可阐释神经痛的分子病理机理及为神经痛的治疗提供药物作用靶点。我们在DGIdb基因—药物作用数据库中，筛查靶向核心调控基因的药物，网络中共筛出5个核心基因和16种药物，这些药物主要作用于调节小胶质细胞的活化和抑制炎症反应。这些药物对神经痛的疗效还需进一步展开实验研究。本研究加深了我们对神经病理性疼痛的神经免疫机制的认识，生物信息学筛查出的疾病相关的核心基因可能会成为神经痛早期诊断生物标志物或者药物治疗靶点。后续还需进一步对这些基因在神经痛中的作用和分子机理展开深入的研究，以期早日明确神经病理性疼痛的分子机理并探索有效的治疗方法。