基于网络药理学研究血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的作用机制

李和教，黄毅岚，黄易

1.海南医学院第一附属医院药学部，海南 海口 570102；2.西南医科大学附属医院药学部，四川 泸州 646000

血管性认知障碍(vascular cognitive impairment，VCI)是由脑血管病变或由血管性因素导致与之有关的认知损害，亦是一种中枢神经系统(central nervous system，CNS)退行性疾病[1]，主要以学习、记忆及社交等能力降低为主要的疾病特点认知功能障碍[2]，多发于中老年。随着社会的老龄化，血管性认知障碍对人们的健康及生活质量的影响越来越明显及其发病率较高，甚至进展成痴呆，这不仅给患者的健康及生活质量带来严重的影响，还给社会及其家庭带来严峻的考验[3]。目前在临床及基础研究针对血管性认知功能障碍的发病机制亦尚未明确，且在临床治疗上没有疗效确切的药物和治疗方案[4]；在中医上采用辨证论治方法，以滋益固肾、活血化瘀、化痰开窍的治疗原则治疗及改善患者的血管性认知功能障碍的症状方面取得良好的临床效果。

血府逐瘀汤是治疗“胸中血府淤血”的常用理血药方之一，具有活血化瘀、行气通络之效，对血管性痴呆具有明显改善作用[5]。有研究显示通过多成分、多层面、多靶点及多通路研究及分析该方所包含的活血化瘀中药，发现血府逐瘀汤及其活性成分具有减轻氧化应激和炎症反应，改善机体微循环障碍等作用，在一定程度可改善或延缓认知功能障碍的恶化[6-9]。

网络药理学主要利用生物信息学和分子生物学等研究方法，通过“成分-潜在靶点-分子通路”网络的构建，从整体上对中药物质基础和药理作用进行系统和多层次的解析[10-12]。本研究运用网络药理学方法，筛选血府逐瘀汤的活性成分靶点，构建“活性成分-潜在靶点”和“成分-潜在靶点-通路”网络，寻找潜在通路，探讨血府逐瘀汤通过多成分、多靶点、多通路发挥治病作用的机制，为其临床应用提供证据，更为血管性认知功能障碍的临床干预治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 血府逐瘀汤活性成分的筛选 通过检索TCMSP 数据库检索血府逐瘀汤的活性成分，根据OB%≥30%和DL≥0.18 条件[13]筛选血府逐瘀汤的活性成分，并且通过PuChem 数据查询活性成分对应的结构式(SMILES)将所得信息录入Excel 表格，且下载2D和3D结构。

1.2 血府逐瘀汤活性成分靶点反向预测 通过将SMILES 依次输入SWISS 数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)[14]中的SWISS，以“人类”为研究物种预测活性成分的靶点，整合去重得到血府逐瘀汤的作用靶点。

1.3 血管性认知功能障碍的靶点获取 利用“vascular cognitive impairment”作为关键词，对Gene-Card等数据库进行疾病靶点的检索及筛选。整合去除重复靶点，即可获得血管性认知功能障碍的相关靶点。

1.4 构建活性成分-潜在靶点网络图 利用韦恩图(Venn diagram)得到成分靶点与疾病靶点的交集，即潜在靶点，使用Cytoscape 3.6.0软件构建活性成分-潜在靶点网络。网络图中的节点(node)分别为活性成分和潜在靶点；边(edge)表示三者的相互关系。使用Cytoscape 中Network Analysis 插件对相应网络进行拓扑性质分析，根据节点连接度(degree)和介数中心性(betweenness centrality)设置网络样式，节点大小反映degree大小，边的粗细反映betweenness centrality大小。

1.5 蛋白质相互关系网络构建和关键靶点筛选 将血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的潜在靶点导入String数据库，得到潜在作用靶点的PPI网络，结果以TSV格式导出结果，将结果中的node1、node2、combined score信息以TXT格式导入Cytoscape软件中进行可视化和Network Analyzer分析，以节点degree 值反映靶点大小和颜色，从而构建蛋白互作网络。以节点度值(degree)和介数中心度(betweenness centrality)大于等于所有点中位数值2倍的靶点，并满足接近中心度(closeness centrality)大于所有点中位数值条件筛选关键靶点作为血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的“关键靶点”，研究关键靶标可能存在的药理作用。

1.6 GO 与KEGG 通路富集分析 通过DAVID 数据库对血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的关键靶点进行GeneOntology 分析(生物过程、分子功能和细胞成分三个层面)和Pathways分析，保存并整理结果，筛选排名靠前的生物过程或信号通路，通过Omicshare进行可视化。

1.7 构建活性成分-潜在靶点-通路网络图 根据KEGG 分析结果筛选出关键基因富集基因数相对大的通路，通过Cytoscape 软件构建活性成分-潜在靶点-通路网络图。

2 结果

2.1 血府逐瘀汤的活性成分筛选结果 通过TCMSP 数据库以及文献分别检索血府逐瘀汤的活性成分及相应靶点等信息，满足OB＞30%和DL＞0.18 条件的成分作为主要活性成分，共得到活性成分212个，其中桃仁23 个、红花22 个、当归2 个、川芎7 个、赤芍29 个、牛膝20 个、柴胡17 个、桔梗7 个、甘草23 个、枳壳5 个、地黄57 个，去重及去除无结构式的活性成分后有105个活性成分，部分主要活性成分见表1。

表1 血府逐瘀汤的主要活性成分信息

2.2 构建血府逐瘀汤活性成分-血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的潜在靶点药理网络 活性成分-潜在靶点药理网络共包括147个节点和519个边，该网络包含了88个化合物节点和59个潜在靶点节点(图1)。红色(node)：潜在靶点；深蓝色(node)：活性成分；这些潜在的活性成分与靶点产生519个相互作用关系。通过Network Analyzer对网络图进行分析，结果显示：与潜在靶点相互作用的活性成分中，甘草查尔酮B、刺槐黄素、刺果甘草查耳酮、橙皮素、柚皮素、槲皮素、山奈酚、甘草宁G、汉黄芩素等大于活性成分的中位数度值，即与6个以上靶点连接，是血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的主要成分；在这个网络中，药物活性成分可作用于相同的靶点，也可作用于不同的靶点，一种成分对应多个靶点，一个靶点也对应多种成分，这体现了其多成分、多靶点的作用特点。

图1 血府逐瘀汤的“成分-靶点”网络图

2.3 蛋白相互作用网络的构建 使用STRING网站对得到的血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的潜在靶点进行分析，为获得更加简洁PPI网络，首先删除了自相作用关系蛋白边，再删除没有相互作用蛋白的节点，在使用Cytoscape软件构建潜在蛋白质-潜在蛋白质相互作用(PPI)网络(图2)。PPI网络中有59个节点和588 个边缘。PPI 网络图中节点的大小与其在网络中的度值呈正相关。节点的度值越大，它在网络中作用越重要，相应的蛋白质靶点在疾病过程中有着更重要的作用。而在PPI图中，用红色飞镖形代表关键蛋白、黄色飞镖形代表其他主要蛋白、蓝色圆形代表其他相关蛋白，在PPI 网络中APP(Degree34)、MAPK 1(Degree34)、TNF (Degree61)、FGF2 (Degree37)、EGFR(Degree38)、VEGFA(Degree39)、IL6 (Degree40)、AKT1(Degree44)蛋白质节点的程度较高，大于节点中位数对应的度的2 倍以上，这些靶点蛋白可能在血管性认知功能障碍的发展中起关键作用，见表2。

表2 血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的关键靶点

2.4 生物通路富集分析 使用DAVID网站对血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的关键靶点进行GO富集分析，得到了P＜0.05的GO条目共计40个，其中包含生物过程(biological process，BP)条目共26 个，最显著的为ERK1 和ERK2 级联正调控、MAP 激酶活性的正调节、MAPK 级联、蛋白激酶B 信号的正调控等；细胞组成(cell composition，CC)分析结果一共有9条，最显著的为细胞表面、质膜、细胞外间隙、胞外区、细胞核等；分子功能(molecular function，MF) 分析结果共有5条，最显著的为酶结合、ATP结合、肝素结合、细胞因子活性、ATP 结合等，各类分别取前20 条。通过对血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的关键靶点进行KEGG 通路分析得到了P＜0.05 的通路共44条，包括PI3K-Akt(磷酸肌醇-3羟激酶/蛋白激酶B)通路、HIF-1(缺氧诱导因子1)信号通路、MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号通路、TNF(肿瘤坏死因子)信号通路、FoxO 信号通路、Ras 信号通路、Toll 样受体信号通路等，见图3。此20 条作用通路均与血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍相关的4 个以上靶基因富集重叠，揭示血府逐瘀汤的有效成分可能通过作用于以上多条信号通路来治疗血管性认知功能障碍。相关通路信息及富集基因见表3。

图2 血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的潜在靶点的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络

图3 GO和KEGG富集分析

表3 血府逐瘀治疗血管性认知功能障碍的关键通路

图4 血府逐瘀汤的“活性成分-潜在靶点-通路”的网络图

2.5 构建血府逐瘀汤活性成分-潜在靶点-通路网络 为研究血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的主要作用通路，本研究将血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍作用的8 个关键靶点蛋白置入DAVID 数据库中进行通路富集分析，将结果中含有特殊疾病信号通路删除，并将结果在Cytoscape软件中构建血府逐瘀汤活性化合物-疾病靶点-通路网络，见图4。共有163个节点和582 个边，有88 个血府逐瘀汤中的化合物，59个主要的血管性认知功能障碍潜在靶点和16 个通路。其中PI3K-Akt 信号通路含有6 个蛋白被富集，HIF-1 信号通路有5 个蛋白被富集，Ras 信号通路有5个蛋白被富集，MAPK 信号通路有5 个蛋白被富集，FoxO 和肿瘤坏死因子通路有4 个蛋白被富集，VEGF信号通路有5 个蛋白被富集，其余通路富集蛋白数量见表3。

3 讨论

血管性认知功能障碍是一种常见的中枢神经系统(central nervous system，CNS)退行性疾病，随着年龄的增长，其对健康和生活质量的影响越来越明显，发病率也越来越高，甚至会发展为痴呆，这不仅严重影响了患者的健康和生活质量，而且也给社会和家庭带来了严峻的考验[3]。针对血管性认知功能障碍的发病机制，目前临床及基础研究尚无定论，在临床治疗中也无疗效确切的药物和方案[4]。中医采用辨证论治方法，以滋养肾、活血化瘀、化痰开窍为原则治疗血管性认知功能障碍，取得较好的临床效果。血府逐瘀汤是治疗“胸中血府淤血”的常用理血方剂之一，具有活血化瘀、通络止痛的功效，对血管性痴呆有明显的改善作用[5]。研究显示，通过多成分、多层面、多靶点、多通路研究及分析血府逐瘀汤及其有效成分，发现具有抗氧化应激、抗炎症、改善机体微循环障碍等作用，并在一定程度上改善或延缓认知功能障碍的恶化[6-9]。因此，本文采用网络药理学方法研究血管性认知功能障碍相关药物及其作用机理，为临床和基础研究奠定基础，对缓解临床症状和改善预后具有重要意义[15]。

本研究分析结果显示，通过TCMSP 数据库检索血府逐瘀汤中各味药的活性成分，并筛选出口服生物利用度(OB)≥30%和类药性值(DL)≥0.18 的血府逐瘀汤活性成分，共得到105 个有效活性成分和59个血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的主要潜在靶点。分析图1 可见，有些化合物能调节多个作用靶点，比如甘草查尔酮B 可调控14 个潜在靶点、柚皮素能影响12 个潜在靶点、懈皮素可以调控10个潜在靶点等，但有少部分化合物只能调节一个靶点，比如β-胡萝卜素仅作用于RBP4 靶点；反过来，一些关键蛋白也能被多种化合物调节和作用，但有部分蛋白质也只受一个化合物调节及影响。如AKT1 蛋白被12 种化合物调控，EGFR 可被31 种化合物调控，而TGFBR2、HLA-DRB1 和VCAM1 仅由一个化合物调控，这说明血府逐瘀汤具有多成分、多靶点间相互作用和作用的特点，一些关键化合物作用于关键靶点起到治疗疾病的主要作用。

血府逐瘀汤治疗VCI 有8 个关键靶点，44 条信号通路和40条GO生物功能过程，主要是通过调节细胞增殖周期、激酶活性、胰岛素抵抗、MAPK 信号通路、PI3K-Akt 信号通路和TNF 通路等多靶点、多途径、多层面发挥作用，有效地改善及治疗血管性认知功能障碍的作用。在图4中可见，一共有163个节点和582个边，该网络包含88个化合物、59个潜在靶点和16个通路。通过GO和KEGG富集分析可见，关键靶点TNF、EGFR、AKT1、MAPK富集于多条分子通路，亦反映关键靶点和分子通路在血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的关键性作用，如6个关键靶点富集于PI3K-Akt(磷酸肌醇-3羟激酶/蛋白激酶B)信号通路，5个关键靶点富集于HIF-1(缺氧诱导因子1)信号通路，5个关键靶点富集于MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号通路，FoxO和TNF通路有4个关键靶点被富集。整个富集中，PI3K-Ak信号通路、MAPK信号通路、FoxO和TNF通路被富集的蛋白最多，这均可说明这些通路在血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的过程中起到关键性作用。

Akt 是PI3K 信号传导途径中一个重要的下游靶激酶，具有调节细胞生长和迁移作用。PI3K/Akt信号通路在神经组织中广泛存在，比如脑组织海马，其PI3K和Akt靶点酶的活化可促进内皮细胞生存、减轻神经元的损伤[16-17]，减少炎症细胞的死亡[18-19]、阻挡神经元凋亡[20-21]；血管性认知功能障碍与许多脑血管疾病有关，大多数患者表现为学习记忆力减退，严重者出现智能障碍和无法自理，其智能障碍呈现进行性发展趋势[22]。研究显示[23]：PI3K/Akt 信号通路存在于各种神经细胞中，通过激活PI3K/Akt 信号通路[24]及提高PI3K、Akt、HIF-1α以及血管内皮生长因子(VEGF)蛋白和基因表达，从而修复及保护神经元、发挥神经保护作用、调节血管舒缩功能[25]、改善脑循环、改善脑组织海马神经元突触可塑形态[26]、改善脑海马神经元超微结构，说明PI3K/Akt通路在神经退行性疾病及脑血管疾病等中发挥重要作用。此外，PI3K/Akt通路的激活可通过调节神经系统中的神经元及各胶质细胞的活性、凋亡及自噬来发挥神经保护效应[27-28]及调节学习记忆功能[25]。葛根素和黄芪均能通过激活PI3K/Akt通路减少大鼠脑缺血再灌注引起神经元细胞的凋亡，起到神经保护作用[29-30]。中药复方补阳还五汤及中药单体化合物(地黄属、鱼草属、车前属等)通过促进脑皮层脑源性神经营养因子的表达，激活PI3K/Akt信号通路的转导作用，从而抑制脑组织神经细胞的凋亡、改善血管血流量及能量、促进神经修复及保护作用，进而保护脑组织及改善认知功能[31]。与之相关的TNF、EGFR、MAPK等主要及关键基因，在血管性认知功能障碍的相关分子通路中起到相应的调节作用，改善认知功能障碍的相应临床表现，为后期的临床研究及基础研究提供更深入的研究方向及靶点。

本文基于网络药理学方法预测血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的潜在靶点预测及研究其分子机制，从多成分、多靶点及多通路等系统层面揭示血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的作用机制，为临床及基础研究血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍的作用成分、关键靶点及其相关机制奠定基础。下一步，我们将对预测的关键靶标和关键通路进行药理学验证，为进一步研究血府逐瘀汤治疗血管性认知功能障碍提供依据。