miR-520c-3p靶向Rab22a抑制肺腺癌细胞迁移和侵袭的研究*

白帅 杨露瑶 屈扬 李慧

2020年全球肺癌新发病例约220万，是全球发病率排名第二位的恶性肿瘤，为导致癌症死亡的首要原因，约占癌症总死亡人数的18%（约180万例）［1］。肺腺癌是肺癌最常见的病理类型［2］。早期肺癌多无明显症状，患者确诊时多已属晚期，5年生存率低。MicroRNAs（miRNAs）是一类长度约为18～25个核苷酸的非编码单链RNA，主要通过与靶基因mRNA的3'UTR区域结合，降解或抑制其翻译，从而参与细胞生长、增殖、分化及凋亡等方面的调控［3］。在肿瘤中异常表达的miRNA可以发挥抑癌或促癌的作用［4］。如miR-21在肺癌中高表达，并可以促进肿瘤的进展［5］，而miR-202和miR-27b可以抑制肿瘤的发展［6-7］。有报道miR-520c-3p可以在乳腺癌和肝细胞癌中发挥抑癌作用［8-9］，但在肺癌中的作用仍未明确。本研究旨在通过检测肺腺癌组织和细胞中miR-520c-3p的表达、生物学功能及靶基因，为肺腺癌的治疗提供新的潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本 本研究共纳入肺腺癌患者118例，标本来源于2010年2月至2015年1月天津医科大学肿瘤医院肿瘤生物样本库。患者病理学诊断明确。本研究获得本院伦理委员会批准。肿瘤组织及癌旁正常组织样本的基本信息见表1。

表1 118例肺腺癌患者及癌旁正常组织样本的基本信息

1.1.2 细胞与主要试剂 肺腺癌细胞系A549购自中国科学院细胞库；胎牛血清、RPMI-1640 购自美国Gibco公司；Trizol和LipofectamineTM2000购自美国In⁃vitrogen 公司；引物（miRNA-520c-3p、U6、Rab22a、GAPDH、双荧光素酶报告基因载体Rab22a 野生型及突变型）由上海生工公司合成；miRNA-520c-3p模拟物和阴性对照（miRNA-NC）购自广州锐博公司；逆转录及荧光定量检测试剂盒（SYBR Green）购自日本Takara 公司，Transwell 小室购自美国Corning 公司；双荧光素酶报告基因检测试剂购自美国Promega公司；Rab22a、GAPDH 抗体购自美国Abcam 公司。倒置显微镜购于日本Olympus公司。电泳槽、转移槽购于美国BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 采用含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养肺腺癌细胞系A549。培养条件为：5%CO2、恒温37℃。依据LipofectamineTM2000 说明书，进行miR-520c-3p 模拟物、阴性对照、Rab22a过表达质粒的转染。

1.2.2 RNA 提取、逆转录及实时荧光定量PCR 分析 使用TRIzol 试剂提取总RNA，并溶于无RNA 酶的DEPC水中。合格样品保存于-80℃冰箱。依照逆转录试剂盒说明书进行逆转录。利用特异性引物，进行RT-qPCR检测。引物序列见表2。反应条件：预变性95℃、30 s；PCR循环95℃、5 s，60℃、34 s，循环40次；结束扩增反应72℃、30 s。采用RT-qPCR 检测miR-520c-3p的表达水平，并以U6为内参，通过比较Ct 值法（2-ΔΔCt）进行定量分析。其中ΔΔCt 样本=ΔCt样本-ΔCt内参。实验重复3次，计算平均值。

1.2.3 质粒构建及双荧光素酶报告基因实验 将Rab22a 3'UTR野生型（WT）和突变型（Mut）序列与psiCHECK-2载体质粒连接，构建荧光素酶报告基因质粒。将Rab22a DNA片段插入pcDNA3载体中以获得Rab22a过表达质粒。依据LipofectamineTM2000转染说明书，将荧光素酶载体与miR-520c-3p模拟物或阴性对照转染到细胞中。48 h后，使用检测试剂测定荧光强度。实验重复3次。

表2 引物序列

表2 引物序列（续表2）

1.2.4 Western blot 检测 使用RIPA 裂解液提取蛋白，后于10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）中进行电泳并转至PVDF 膜。用5%脱脂牛奶室温封闭2 h。4℃一抗孵育过夜。室温二抗孵育1 h。ECL发光试剂显影。GAPDH作为对照。

1.2.5 Transwell实验 1）侵袭实验：细胞悬液加入涂有Matrigel 胶的上室。下室加入胎牛血清作为趋化因子。2）迁移实验：上层小室中无Matrigel 胶。37℃培养24 h。4%多聚甲醛固定。结晶紫染色。去除上层小室的细胞。在显微镜下计数。

1.2.6 生物信息学分析 使用TargetScan、miRTar⁃Base 和miRDB 数据库预测靶基因。通过clusterPro⁃filer软件包进行KEGG分析。

1.2.7 随访 采用电话联系的方式进行随访，分析患者疾病进展情况。全部病例随访至2015年2月，中位随访时间为37（21.25～54.00）个月。失访10例，随访率为91.53%。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料使用t检验或秩和检验。采用Pearson 相关检验评估相关性。使用Kaplan-Meier 法分析患者的生存预后。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-520c-3p在肺腺癌组织中的表达

收集118例肺腺癌组织标本，检测miR-520c-3p的表达水平。结果显示在不同分期的肺癌组织中，miR-520c-3p的表达量低于癌旁组织（P＜0.000 1，图1A）。通过生存分析发现，尽管miR-520c-3p高表达组与低表达组间无病生存期（disease-free survival，DFS）无显著性差异（P=0.822，图1B），但在临床Ⅰ期的患者中，高表达miR-520c-3p的患者DFS明显长于低表达组（P=0.033，图1C）。以上结果表明miR-520c-3p在肺腺癌组织中低表达，并且高表达提示患者预后更好。

2.2 miR-520c-3p抑制肺腺癌细胞的迁移及侵袭

在人肺癌细胞系A549中过表达miR-520c-3p，通过Transwell实验检测对细胞侵袭及迁移能力的影响。结果提示，miR-520c-3p过表达组的A549细胞穿膜细胞数明显少于阴性对照组（图2A），差异具有统计学意义（迁移，P＜0.001；侵袭，P＜0.001，图2B）。提示miR-520c-3p可以抑制肺腺癌细胞的迁移及侵袭能力。

图1 miR-520c-3p的表达水平及与预后的关系

图2 miR-520c-3p抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力

2.3 生物信息分析对miR-520c-3p的预测

通过TargetScan、miRTarBase 和miRDB 数据库进行生物信息学分析，确定87个候选基因（图3A）。进一步KEGG 分析提示，候选基因集中于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路（图3B）。因此，提示与此信号通路密切相关的Rab22a 可能是miR-520c-3p调控的靶基因。

2.4 肺腺癌组织及细胞系中miR-520c-3p 和Rab22a mRNA的相对表达量

检测118 例肺腺癌组织样本中miR-520c-3p 和Rab22a mRNA表达水平发现，肺腺癌患者miR-520c-3p 与Rab22a mRNA 水平呈负相关（图4A）。A549 细胞系分别转染miR-520c-3p mimics 与阴性对照后，采用Western blot检测Rab22a蛋白质水平（图4B），发现在miR-520c-3p 过表达组，Rab22a 表达降低比阴性对照组降低显著，进一步提示miR-520c-3p 与Rab22a可能存在调控关系。

2.5 Rab22a是miR-520c-3p的直接靶基因

基于生物信息学分析，构建野生型或突变型Rab22a-3'UTR序列（图4C）。基于此序列的荧光素酶报告实验发现，野生型Rab22a-3'UTR双荧光素酶报告载体与miR-520c-3p mimics共转染组的荧光素酶活性显著降低（图4D），提示miR-520c-3p可以直接结合Rab22a-3'UTR，即Rab22a是miR-520c-3p的直接靶基因。

2.6 miR-520c-3p靶向Rab22a抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭

采用挽救（rescue）实验，将pcDNA3-Rab22a过表达质粒或pcDNA3空载质粒与miR-520c-3p mimics共转染肺腺癌细胞。Transwell实验证实，Rab22a过表达可以抵消miR-520c-3p对细胞迁移侵袭能力的抑制作用（图5），表明miR-520c-3p是通过抑制Rab22a的表达，从而抑制肺腺癌细胞迁移和侵袭能力。

图3 生物信息分析对miR-520c-3p的预测

图4 肺腺癌组织及细胞系中miR-520c-3p和Rab22a mRNA的相对表达量

图5 miR-520c-3p靶向Rab22a抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭

3 讨论

MicroRNAs（miRNAs）是一类长度约为18～25个核苷酸的非编码单链RNA。哺乳动物中，miRNA 首先由RNA 聚合酶Ⅱ转录产生初级miRNA（pri-miR⁃NA）。随后由细胞核内的Drosha/DGCR8复合物加工成前体miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA 被Expor⁃tin5-Ran-GTP 复合物转运到细胞质，并被Dicer 酶与dsRBP蛋白剪切为双链miRNA。双链miRNA被转载进AGO2，形成RISC（RNA诱导沉默复合体）参与转录后调控。双链中的一条链保存在RISC 复合物中，另一条链则被迅速降解。在肿瘤细胞中，miRNA 是转录后调控的重要组成部分，可以通过调节肿瘤的增殖、生长、凋亡、转移等方式发挥促癌或抑癌的作用［10］。如miR-520 家族在多种肿瘤中异常表达并发挥关键的生物学作用。本研究发现miR-520c-3p 可以通过抑制靶基因Rab22a从而抑制肺腺癌细胞的迁移与侵袭的能力。有报道miR-520c-3p 在不同肿瘤中发挥不同的功能。如miR-520c-3p在纤维肉瘤、前列腺癌和胃癌中发挥促癌的作用，但在结肠癌和肝细胞癌中发挥抑癌作用［9，11］。在肺癌中，有研究报道miR-520c-3p在肿瘤组织中低表达，并可通过靶向转录因子Yin Yang 1（YY1）抑制肿瘤的生长，但miR-520c-3p对肺腺癌患者生存的影响尚未明确［11］。

本研究通过RT-qPCR 分析发现，miR-520c-3p在肿瘤组织中低表达，并且高表达提示预后更好。此外，miR-520c-3p可以抑制肺腺癌细胞的迁移与侵袭的能力。为进一步明确miR-520c-3p的作用机制，本研究首先进行了生物信息学分析，结果提示Rab22a可能为miR-520c-3p的靶基因。

Rab22a 是Ras 超家族中的一员，在内吞作用、囊泡运输、细胞骨架形成等方面均发挥重要作用［12］。已有报道Rab22a在结直肠癌、脑胶质瘤、胃癌中高表达，并发挥促癌作用［13-15］。Rab22a 是树突状细胞内MHC-Ⅰ类分子转运的关键蛋白，因此也是有效抗原提呈的重要保证［16］。此外，Rab22a 在肺癌中可以通过调节CD147 的膜定位，促进肺癌细胞的迁移和侵袭［17］。但是，Rab22a 与非编码RNA 之间的调控关系并未明确。本研究通过RT-qPCR 分析发现Rab22a与miR-520c-3p的表达水平之间呈负相关。随后，双荧光素酶报告基因检测证实miR-520c-3p 可直接调控Rab22a。进一步的挽救实验表明，Rab22a 过表达可以抵消miR-520c-3p 对细胞迁移浸润能力的抑制作用。因此，miR-520c-3p 通过直接抑制Rab22a 的表达，进而抑制了肺腺癌细胞迁移和侵袭。

目前，多种miRNA 已进入临床试验阶段。如澳大利亚已开展miR-16类似物对恶性胸膜间皮瘤或非小细胞肺癌患者的Ⅰ期临床试验，并且初步结果较积极。miR-34 类似物已于2013年进入一项多中心Ⅰ期临床试验，用于包括肺癌在内的多种肿瘤的治疗，但因受试者出现严重免疫相关不良反应而被终止。此外，miR-22 已进入多中心的Ⅱa 期临床试验，用于丙型肝炎的治疗。目前，临床应用的困难在于筛选出肿瘤特异性的miRNA，并保证其有效性和安全性［18］。因此，要解决此难点，就需要对miRNA在肺癌发生发展中的作用及其机制进行更为深入的研究。

综上所述，本研究结果表明miR-520c-3p通过直接靶向负调控Rab22a，抑制了肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力。此外，高表达miR-520c-3p的临床Ⅰ期肺腺癌患者的预后更佳。因此，miR-520c-3p是肺腺癌潜在的治疗靶点。