TET对舌鳞癌细胞SCC9生长、运动和裸鼠体内成瘤的影响及机制研究

牛 兵，王国芳，李坤阳，丁 虹，刘爱群

舌鳞癌是人类最常见的头颈部恶性肿瘤之一，研究表明舌鳞癌约占全部口腔恶性肿瘤的30%。相比其他口腔恶性肿瘤，由于舌部血供丰富，淋巴引流广泛，舌鳞癌患者往往会出现淋巴结侵润与转移等现象，同时舌鳞癌具有局部侵袭性、转移性、复发率高、愈后较差等特点。寻找舌癌有效治疗方法十分迫切。汉防己甲素(tetrandrine，TET)是一种从中草药防己科植物粉防己的块根中提取的双苄基异喹啉类生物碱。目前临床上主要用于风湿性疼痛、关节炎、神经痛、矽肺等疾病的治疗。近年来，TET在肿瘤治疗中的效果得到了一步得到证实，TET对肝癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌等癌细胞的增殖、侵袭及迁移有一定的影响。该文通过研究TET对舌鳞癌细胞SCC9生长、运动和裸鼠体内成瘤的影响，以期了解TET对舌鳞癌细胞SCC9生长、运动和裸鼠体内成瘤的影响及作用机制，从而为舌鳞癌患者治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

舌鳞癌SCC9细胞购自中国科学院细胞库。裸鼠60只，体质量 (15±2)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK(京)2017-0022，普通级，分12个笼子饲养，5只/笼，饲养于郑州大学动物中心实验室，饲养温度20～25 ℃，相对湿度50%～65%，该实验经过动物伦理委员会批准同意。TET(货号：B10395-100；纯度>98%)购自上海士锋生物科技有限公司；Ki67、Caspase-3抗体购自上海艾博抗有限公司；血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)抗体购自美国Sino Biolocgical公司；磷酯酰肌醇-3 激酶( phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、p-PI3K、AKT、p-AKT抗体购自美国Sigma公司；mTOR、p-mTOR抗体购自上海Santa Cruze Biotechnology 公司；磷酸缓冲液PBS购自天津科密欧有限公司；4-硝基喹啉-1-氧化物购自美国Sigma 公司。低温离心机购自湖南恒诺离心机有限公司；光学显微镜购自东莞市同创仪器有限公司；荧光分光光度计购自上海仪电分析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1

分组干预

将舌鳞癌SCC9细胞分为：空白对照组、低剂量TET组、中剂量TET组、高剂量TET组，分别使用0、2.5、5、10 μmol/L 的TET预处理。

将60只裸鼠分为：空白对照组、低剂量TET组、中剂量TET组、高剂量TET组，每组各15只，分别口服灌胃TET 0、12.5、25、50 mg/(kg·d)。

1.2.2

细胞培养

将舌鳞癌SCC9细胞培养于含10% FBS、100 U/ml 青霉素和100 U/ml链霉素RPMI1640 培养基中，保存在温度为37 ℃、5%CO的培养箱内培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.3

建立模型

建立舌鳞癌动物模型及判断建模是否成功参考蒋灿华 等实验方法。采用0.002% 4- 硝基喹啉- 1- 氧化物自然饮水喂养36周，诱发建立舌鳞癌动物模型，造模中途有裸鼠死亡立即补上。

1.2.4

克隆形成实验检测细胞生长

取对数生长期细胞，制作1×10/ml单细胞悬液并计数，并将细胞种到6孔板中分细胞梯度培养，2周后微镜下可见明显克隆形成，结晶紫染色后拍照，并计算克隆形成率。

1.2.5

流式细胞术检测细胞凋亡情况

恒温离心机保持4 ℃，离心 5 min 收集细胞；收集细胞后加入 100 μl Binding Buffer 重悬细胞并加入5 μl Annexin V-FITC和 5 μl PI，轻轻混匀；室温避光孵育 15 min并加入400 μl Binding Buffer 使用流式细胞仪检测。

1.2.6

Transwell检测细胞侵袭情况

参照Hu et al的Transwell研究方法。将细胞培养 24 h后，制成无 FBS 悬浮液恒温培养1 d后，随机选取视野使用显微镜观察细胞形态，同时统计细胞数量。

1.2.7

Western

blot检测蛋白表达水平

按照Western blot 检测方法操作，使用蛋白质条带用扫描仪进行扫描，以GAPDH为内参，应用Imagaquent 5.1软件对Ki67、Caspase-3、VEGF、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamy-cin，mTOR) 、p-mTOR蛋白质条带灰度进行相对定量分析。小鼠单克隆抗体Ki67、Caspase-3、VEGF、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR克隆IgG1(稀释比例均为1 ∶1 000)，HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG二抗(稀释比例均为1 ∶5 000)以目的蛋白条带与β-actin灰度比值表示蛋白相对表达水平。实验重复3次，取平均值为最终结果。

1.2.8

免疫组化染色检测相关蛋白的表达

取小鼠舌鳞癌组织切片，经过烤片、常规二甲苯脱蜡、酒精脱水、在37 ℃下孵育10 min，PBS冲洗、修复抗原、封闭、滴加一抗后在4 ℃下孵育过夜，使用苏木精复染、透明、干燥、封片。

1.2.9

裸鼠模型试验

将60只裸鼠皮下注射舌鳞癌细胞SCC9建立舌鳞癌模型，分别口服灌胃将低中高剂量12.5、25、50 mg/(kg·d)的TET，并设置空白对照组，注射等量的0.9%氯化钠溶液。29 d后，检测瘤子重量，免疫组化法检测结肠癌组织Ki67、caspase-3和VEGF 的表达。

2 结果

2.1 舌鳞癌SCC9细胞增殖情况

由图1可见，与空白对照组比较，低剂量TET组细胞克隆形成率和细胞增殖相关蛋白Ki67表达水平降低(

P

<0.05)；与低剂量TET组比较，中剂量TET组细胞克隆形成率和细胞增殖相关蛋白Ki67表达水平降低(

P

<0.05)；与中剂量TET组比较，高剂量TET组细胞克隆形成率和细胞增殖相关蛋白Ki67表达水平降低(

P

<0.05)。

2.2 舌鳞癌SCC9细胞凋亡情况

由图2可见，与空白对照组比较，低剂量TET组细胞凋亡率及凋亡相关蛋白Caspase-3表达水平升高(

P

<0.05)；与低剂量TET组比较，中剂量TET组细胞凋亡率及凋亡相关蛋白Caspase-3表达水平升高(

P

<0.05)；与中剂量TET组比较，高剂量TET组细胞凋亡率及凋亡相关蛋白Caspase-3表达水平升高(

P

<0.05)。

2.3 舌鳞癌SCC9细胞侵袭情况

由图3可见，与空白对照组比较，低剂量TET组舌鳞癌细胞SCC9侵袭数目及细胞迁移相关蛋白VEGF表达水平降低(

P

<0.05)；与低剂量TET组比较，中剂量TET组舌鳞癌细胞SCC9侵袭数目及细胞迁移相关蛋白VEGF表达水平降低(

P

<0.05)；与中剂量TET组比较，高剂量TET组舌鳞癌细胞SCC9侵袭数目及细胞迁移相关蛋白VEGF表达水平降低(

P

<0.05)。

图1 舌鳞癌SCC9细胞克隆形成率及Ki67表达情况

图2 舌鳞癌SCC9细胞凋亡情况

2.4 TET对舌鳞癌SCC9细胞相关信号通路影响

由图4可见，与空白对照组比较，低剂量TET组PI3K、AKT、mTOR表达水平差异无统计学意义，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达水平及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR降低(

P

<0.05)；与低剂量TET组比较，中剂量TET组的PI3K、AKT、mTOR表达水平差异无统计学意义，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达水平及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR降低(

P

<0.05)；与中剂量TET组比较，高剂量TET组PI3K、AKT、mTOR表达水平无差异无统计学意义，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达水平及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR降低(

P

<0.05)。

2.5 TET对裸鼠体内成瘤的影响

由图5可见，与空白对照组比较，低剂量TET组裸鼠肿瘤细胞质量、Ki67阳性率、VEGF阳性率降低(

P

<0.05)，CaspasE-3阳性率升高(

P

<0.05)；与低剂量TET组比较，中剂量TET组裸鼠肿瘤细胞质量、Ki67阳性率、VEGF阳性率降低(

P

<0.05)，CaspasE-3阳性率升高(

P

<0.05)；与中剂量TET组比较，高剂量TET组裸鼠肿瘤细胞质量、Ki67阳性率、VEGF阳性率降低(

P

<0.05)，CaspasE-3阳性率升高(

P

<0.05)。

图3 舌鳞癌SCC9细胞侵袭情况

图4 TET对舌鳞癌SCC9细胞相关信号通路影响

3 讨论

增殖细胞周期相关核抗原(Ki67)的分子量为345 ku，它所编码的基因位于10号染色体上，是一种细胞核内与细胞分裂增殖相关的蛋白抗原，其表达水平反映细胞增殖的敏感指标同时这种基因在维持结构方面起着重要作。石小燕 等发现,Ki67的表达与细胞增殖密切相关，是调节细胞周期重要组成部分。本研究显示，使用TET处理后细胞中Ki67水平降低，说明TET可以抑制Ki67的表达，从而抑制癌细胞的增殖，且随着使用TET处理的浓度的升高对癌细胞抑制程度增强。郑骏年 等研究表明，降低细胞内Ki67的表达可以有效降低癌细胞的增殖，达到抑制癌细胞的作用，与本研究得出的结论相一致。

凋亡也是调控癌细胞必不可少的重要调控因子。其中Caspase是细胞凋亡的核心，Caspase-3、Caspase-9等是Caspase家族的凋亡因子。Caspase-9基因处于Caspase 家族激活基因的顶端，是Caspase家族中最常见的凋亡启动子，通过自身的裂解使得 proCaspase-3 产生有活性的 Caspase-3。这种有活性的 Caspase-3是执行凋亡的基因，主要作用机制是通过剪切另外的 Caspase 底物引起级联反应，最终导致细胞凋亡。本实验中可以看出，使用TET处理后细胞中Caspase-3水平升高，说明TET可以有效促进细胞中的Caspase-3表达，使得癌细胞凋亡，且随着使用TET处理的浓度的升高对癌细胞促凋亡作用增强。刘安 等研究表明：升高癌细胞中Caspase-3的表达可以促进癌细胞的凋亡，与本研究得出的结论相一致。

图5 TET对裸鼠体内成瘤的影响

PI3K受到各种生长因子等刺激后，PI3K的激活将导致 3，4-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2) 转化为3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇 (PIP3) 再激活诸多下游蛋白。Akt是一种进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，PI3K活化后会在细胞膜上生成PIP3，形成的PIP3再和 Akt N端的PH结构域结合，使得Akt从细胞质转移到细胞膜上。磷酸化Akt蛋白被激活后再到胞浆中或者胞核内，将磷酸化一系列底物，进而发挥促进细胞增殖。哺乳动物mTOR是PI3K蛋白激酶类家族的一员，存在两种不同的复合体:mTOR和raptor(regulatory-associated protein of mTOR)可以促进Akt分子中的残基磷酸化，导致Akt的激活。PI3K/AKT/mTOR信号通路在肿瘤中有多种作用，其中包括：抑制细胞凋亡、促进肿瘤转移、增加肿瘤的耐药性、抑制参与细胞自噬。本研究显示使用TET可以有效抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进了癌细胞的凋亡、抑制了肿瘤转移调控了细胞的凋亡，与秦蓉 等研究表明TET可以有效抑制肿瘤的增殖、侵袭及凋亡的结论相一致。

综上所述，TET以通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制舌鳞癌细胞的生长、运动，促进舌鳞癌细胞的凋亡，其作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白、促进凋亡因子Caspase-3的表达有关。但调控PI3K/AKT/mTOR信号通路的相关下游和上游位点蛋白较多，在后续的实验中可以进一步探讨TET调控PI3K/AKT/mTOR信号通路上游或下游的相关其他位点对PI3K/AKT/mTOR信号通路机制的影响。