HOTAIR过表达慢病毒载体的构建及稳定细胞株的建立

李晓娟，王 珏，何建萍，吕梦欣，钱 源1,,,5,6,7

子痫前期(preeclampsia，PE)是严重威胁母儿健康的妊娠期特有疾病，可引起全身多系统功能失调。研究表明其发病机制可能与胎盘缺氧及灌注不良密切相关。子宫螺旋动脉重注不良可引起胎盘侵袭功能不足，胎盘灌注减少，继而导致PE的发生。长链非编码RNA(long non-cording，lncRNA)虽不编码蛋白质但可通过转录后修饰和表观遗传修饰等方式参与基因表达调控，研究表明lncRNA与滋养细胞功能及胎盘分化、发育密切相关。目前已报道PE胎盘中IGF2/H19、MEG3、HOTAIR等多种lncRNA异常表达。HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是一种典型的lncRNA，目前研究表明其可通过调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭等功能参与多种肿瘤的发生。但HOTAIR与PE的发病机制是否相关目前尚未阐明。

慢病毒是一类从人类免疫缺陷Ⅰ型(human immunodeficiency type I，HIV-Ⅰ)病毒上改造而成的病毒载体，属于逆转录病毒，其可将自身的病毒RNA逆转录为DNA，并与宿主细胞染色体整合，达到目的基因在宿主细胞内长期、稳定表达的目的。与质粒及其他病毒载体相比，慢病毒具有感染效率高、转移基因片段容量大(10 kb左右)、低免疫原性和低细胞毒性等优点，是携带目的基因的理想载体。该研究以慢病毒作为载体携带HOTAIR基因入HTR-8/Svneo细胞，以实现HOTAIR在人滋养细胞内持续稳定地表达。为进一步探讨HOTAIR在人滋养细胞中的作用及其分子机制提供有力的支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

293T细胞购自中国科学院细胞库，HTR-8/SVneo细胞购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。胎牛血清(以色列Biological Industries公司)，DMEM、RMPI-1640培养基、胰酶Trypsin-EDTA Solution、双抗(青链霉素)(美国gibco公司)，HOTAIR引物、RNAi-Mate转染试剂(上海吉玛制药技术有限公司)，Polybrene(德国Sigma公司)。NotI和BamHI、DNA内切酶、DNA连接酶、DNA marker(加拿大Fermentas公司)。ClonExpressEntry One Step Cloning Kit (南京诺唯赞生物科技有限公司)，琼脂糖、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒(北京天根生化有限公司)，中量抽提试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)。10 cm培养皿、96孔板、50 ml离心管(美国Corning公司)，过滤器(德国Sartorius Stedim公司)。

1.2 方法

1.2.1

HOTAIR过表达重组慢病毒载体的构建及鉴定

根据HOTAIR基因全序列设计PCR引物并在上下游分别加上NotI和BamHI限制性内切酶酶切位点，同样方法设计无义序列NC组引物。通过2轮PCR反应获得目的基因相应的目的片带。片段利用EcoRV克隆到pUC57中，测序验证得到阳性克隆。并用ClonExpressEntry One Step Cloning Kit，将扩增好的片段重组克隆到线性化的LV5载体中。将连接产物转化感受态细胞，将转化后的菌液接种到LB琼脂培养基(含50 mg/L氨苄青霉素)上，37 ℃温箱倒置培养16 h。挑取克隆菌落用质粒小提试剂盒抽提质粒并用NotI和BamHI对目的基因及LV5载体进行双酶切鉴定，对鉴定正确的质粒进行测序验证。测序比对正确的即为构建成功的目的基因表达质粒载体，将构建好的质粒载体进行超纯去内毒素抽提。

1.2.2

慢病毒包装、收集及滴度检测

将重组慢病毒质粒LV5-HOTAIR与穿梭质粒A032和包装质粒(pGag/Pol)经RNAi-mate共转染293T细胞，6 h后换液，继续培养72 h。将上清液4 000 r/min，离心4 min后用0.45 μm过滤器过滤收集病毒浓缩液，通过荧光显微镜应用倍比稀释法检测病毒的滴度。

1.2.3

过表达HOTAIR慢病毒感染及稳定株筛选

选取P3～P6代HTR-8/Svneo细胞，待细胞密度达到50%时，加入HOTAIR慢病毒载体。实验分组为Control、HOTAIR-NC及HOTAIR不同感染复数(MOI)组：HOTAIR-1、HOTAIR-2、HOTAIR-4、HOTAIR-8组。转染24 h后换液，72 h后荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表达情况并收集各组细胞用qRT-PCR检测HOTAIR表达水平，以确定病毒最佳感染复数。将HOTAIR组及HOTAIR-NC组慢病毒在最佳感染复数浓度下转染HTR-8/Svneo细胞，用含有终浓度为1 μg/ml嘌呤霉素(预实验筛选的最佳浓度)的培养基传代筛选HOTAIR稳定株，稳定株经传3代后荧光显微镜观察GFP的表达情况并收集细胞经qRT-PCR检测HOTAIR表达情况。

1.2.4

qRT

-

PCR检测HOTAIR

mRNA的表达

用TRIzol收集细胞，提取总RNA，用酶标仪RNA进行定量，琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性。以基因特异性引物进行PCR扩增，以β-actin作为内参。HOTAIR引物序列: F: 5′-CAAACAGAGTCCGTTCAGTGTC-3′；R: 5′-TTCTTAAATTGGGCTGGGTC-3′。β-actin引物序列: F: 5′- AAACGTGCTGCTGACCGAG-3′；R: 5′- TAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3′。反应条件：95 ℃、3 min；95 ℃、12 s，62 ℃、40 s(40个循环)。实验重复3次，以2进行基因表达的相对定量，确定过表达效率。

2 结果

2.1 重组慢病毒质粒鉴定

重组慢病毒质粒LV5-HOTAIR经NotI和BamHI双酶切后行琼脂糖凝胶电泳，结果重组质粒酶切后可观察到一条2 000～2 500 bp的目的条带(图1)，电泳结果与理论值2 364 bp相符。重组质粒送测序验证结果显示，重组质粒中插入的目的片段与HOTAIR基因序列完全一致，无碱基突变以及碱基插入、缺失等异常(图2)，表明HOTAIR慢病毒表达载体构建成功。

图1 重组质粒NotI和BamHI双酶切鉴定图片

图2 重组慢病毒质粒HOTAIR插入片段的部分测序图谱

2.2 病毒滴度检测结果及荧光显微镜下绿色荧光表达情况

HOTAIR慢病毒的滴度为1×10TU/ml，HOTAIR-NC慢病毒的滴度为2×10TU/ml。转染慢病毒后的HTR-8/Svneo细胞用含有终浓度为1 μg/ml嘌呤霉素的培养基传代筛选HOTAIR稳定株，嘌呤霉素筛选3代后细胞几乎无死亡现象，表明剩余的细胞均是含有嘌呤抗性的细胞，荧光显微镜下观察过表达HOTAIR组与NC组细胞均有绿色荧光表达(图3)。

2.3 qRT-PCR检测HOTAIR表达情况

qRT-PCR检测结果表明：① 不同感染复数的慢病毒转染72 h后，HOTAIR组HOTAIR表达比Control组及HOTAIR-NC组均升高，MOI为4时HOTAIR表达水平最高，选择这个浓度为后续转染条件(图4)。② 稳定转染HOTAIR组HOTAIR表达量是Control组的206.3倍(

t

=196.9，

P

<0.05)，是HOTAIR-NC组的232.8倍(

t

=197.6，

P

<0.05)HOTAIR稳定高表达细胞株构建成功(图5)。

3 讨论

PE与胎盘功能障碍密切相关，子宫螺旋动脉重铸不佳，导致胎盘缺血，进而促进血管活性因子的释放、血管内皮功能障碍引起PE的发生。可见胎盘功能障碍在PE发生发展中起重要作用。目前研究表明HOTAIR在PE胎盘中表达异常，HOTAIR与胎盘功能障碍密切相关。Mohammadpour-Gharehbagh et al发现母体外周血及胎盘HOTAIR rs10783618多态性变化可能增加PE易感性。Zhang et al发现PUM1与HOTAIR结合后降低HOTAIR的半衰期，降低HOTAIR的稳定性，通过转录后调控机制下调HOTAIR的表达抑制滋养细胞的侵袭能力参与PE的发生。但HOTAIR与PE发病机制的研究仍相对不足，为进一步研究HOTAIR对滋养细胞功能影响及下游具体的机制，本课题组构建了HOTAIR过表达载体，通过慢病毒包装提高其转染效率，并筛选出稳定高表达HOTAIR的HTR-8/SVneo细胞株。

此次研究只构建了HOTAIR过表达载体后续将进一步完善HOTAIR抑制载体的构建。下一步拟探讨HOTAIR对滋养细胞功能的影响，及对胎盘功能相关信号通路的影响。本实验成功构建了HOTAIR慢病毒过表达载体，为后续细胞功能学实验提供良好基础，也为进一步研究提供可行性。为进一步探讨HOTAIR功能及其在PE发生、发展中的作用和机制奠定了基础。

图3 荧光显微镜下观察稳定转染HOTAIR、HOTAIR-NC慢病毒的HTR-8/Svneo细胞 ×200

图4 qRT-PCR检测不同感染复数HOTAIR慢病毒转染HTR-8/Svneo细胞后HOTAIR表达水平

图5 qRT-PCR检测HOTAIR慢病毒稳定转染HTR-8/Svneo细胞中HOTAIR表达水平