盐酸青藤碱通过C/EBPβ-COX-2通路抑制LPA诱导的肝癌细胞增殖

王 新，卢朝辉，李雅睿，郭 丹，张 旭，曹 琰，李皓瑞，和水祥，卢新兰

由于非酒精性脂肪肝及其相关性肝癌患病人数逐年增加，其致癌机制是目前的研究热点。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)是一种脂代谢中的磷脂分子，具有类生长因子的生物活性，可能是肝脏炎症、脂代谢紊乱与肝癌发生之间重要的桥梁分子。环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)是前列腺素合成限速酶，在肝癌等多种癌组织中过表达。在卵巢癌中，LPA可通过转录因子CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)诱导COX-2高表达。多种抗炎药同时具有抗肿瘤活性。青藤碱是从中药青风藤中提取出的生物碱单体，盐酸青藤碱(sinomenine hydrochloride，SIN)是水溶性盐酸盐，具有抗炎、抗免疫药理作用，临床上用于治疗关节炎，课题组前期研究已证实其抗肝癌活性。目前在肝癌中LPA与COX-2关系如何及SIN是否调控LPA相关信号通路尚不清楚。该研究探讨LPA能否诱导人肝癌Huh7细胞COX-2表达、增殖及其可能机制，并验证SIN对其可能的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系与试剂

人肝癌Huh7细胞由西安交通大学第一附属医院泌尿外科研究所冻存保种。SIN(纯度>98%)购自上海abcam公司；MTT、DMSO、LPA(纯度>98%)购自上海Sigma-Aldrich公司，其中LPA用PBS溶解成母液，由无血清细胞培养液稀释成工作液；DMEM培养液购自美国Gbico公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；小鼠抗人C/EBPβ、COX-2、GAPDH单抗均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；辣根过氧化物酶标记二抗购自北京中杉金桥生物公司；Fast 200总RNA极速抽提试剂盒购自上海飞捷生物公司；逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Real-time PCR试剂盒购自大连宝生物公司。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养

人肝癌Huh7细胞常规培养采用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 U/ml链霉素的高糖DMEM培养液，培养于5% CO、湿度95%、37 ℃的恒温细胞培养箱内。待细胞生长到铺满细胞培养皿底面80%左右进行传代。细胞在用LPA处理前用无血清培养液培养24 h。

1.2.2

Real

-

time

PCR测定mRNA表达水平

采用Fast 200总RNA极速抽提试剂盒提取不同处理组Huh7细胞总RNA，定量后按0.4 μg上样量逆转录合成cDNA。定量逆转录反应产物调整后浓度为0.2 g/L，上样量为200 ng，按照说明书进行Real-time PCR反应。GAPDH为内参对CHOP mRNA的表达量进行标准化处理。反应体系(20 μl)：10 μl SYBR，0.2 μg模板cDNA，正反向引物浓度均为20 μmol/L，体积为0.8 μl，使用灭菌蒸馏水使总体积达20 μl。PCR过程：40个循环、94 ℃、1 min；54 ℃、1 min；聚合72 ℃、1 min；延伸72 ℃、7 min。mRNA的相对表达倍数使用公式2计算。根据NCBI官网提供的人基因信息，按照引物设计原则设计人C/EBPβ、COX-2和GAPDH基因引物序列。C/EBPβ正向引物：5′-TTCCTCTCCGACCTCTTCTC-3′，反向引物：5′-CCAGACTCACGTAGCCGTACT-3′；COX-2正向引物：5′-AAGTCCCTGAGCATCTACG-3′，反向引物：5′-TTCCTACCACCAGCAACC-3′；GAPDH正向引物：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG-3′，反向引物：5′-GACGGTGCCATGGAATTTGC-3′。

1.2.3

Western

blot测定蛋白表达水平

Huh7细胞给予不同处理后，加入RIPA全蛋白裂解液(含Cocktail和PMSF)提取细胞总蛋白。用Bradford法测定裂解产物的蛋白浓度。30 μg的蛋白样品上样至120 g/L的SDS-PAGE凝胶进行电泳分离蛋白，随后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。在室温下用5%的脱脂牛奶封闭1 h，然后加入适量一抗稀释液在4 ℃下孵育过夜，TBST缓冲液洗膜后加入适量二抗稀释液在室温条件下孵育1 h。采用ECL检测系统进行显色、曝光、冲洗X胶片，使用扫描仪进行扫描。

1.2.4

MTT法检测细胞增殖

人肝癌Huh7细胞经消化、离心后，以6 000个/孔接种于96孔板，培养过夜，待细胞贴壁后，换成无血清培养液继续培养24 h，将细胞分为：对照组(无血清培养液)、LPA组(10 μmol/L)、SIN+LPA组。SIN+LPA组中细胞先加入SIN(100、400 μmol/L)预处理1 h，随后加入10 μmol/L LPA。上述各组细胞处理后培养24 h后，原培养液被吸除后加入MTT工作液(0.5 g/L)200 μl，继续孵育4 h后将MTT工作液吸除，在每孔中加入DMSO(150 μl)后于振荡器上振荡10 min，将酶标仪吸收波长设定为490 nm，测出每孔的相对吸光度(optical density, OD)值。相对细胞活力(%)=处理组OD值/对照组OD值×100%。

2 结果

2.1 LPA时间依赖性诱导人肝癌Huh7细胞C/EBPβ和COX-2表达

无血清培养液培养24 h后，用10 μmol/L LPA处理人肝癌Huh7细胞0、0.5、1、2、4、6 h。收集细胞总蛋白后，通过Western blot显示LPA能够时间依赖性上调Huh7细胞的C/EBPβ和COX-2蛋白表达水平，其中LPA处理6 h后变化最为显著(图1A)。用10 μmol/L的LPA处理细胞2、6 h，提取细胞总RNA后通过Real-time PCR检测显示，LPA能够时间依赖性上调C/EBPβ和COX-2的mRNA表达水平(图1B)。

图1 LPA时间依赖性上调人肝癌Huh7细胞的C/EBPβ和COX-2表达

2.2 LPA浓度依赖性诱导人肝癌Huh7细胞C/EBPβ和COX-2表达

LPA处理组为各浓度LPA(0、0.5、1、5、10 μmol/L)分别处理细胞6 h，收集细胞总蛋白后，通过Western blot显示LPA能够浓度依赖性上调人肝癌Huh7细胞C/EBPβ和COX-2蛋白表达水平，其中10 μmol/L LPA浓度组变化最为显著(图2A)。用1、10 μmol/L的LPA分别处理细胞6 h，提取细胞总RNA并通过Real-time PCR技术检测显示，LPA能够浓度依赖性上调C/EBPβ和COX-2的mRNA表达水平(图2B)。

2.3 SIN通过下调C/EBPβ、COX-2表达抑制LPA所诱导的人肝癌Huh7细胞增殖

SIN+LPA组细胞中加入不同浓度(100、200、400、800 μmol/L)SIN预处理1 h后加入10 μmol/L LPA，LPA组中仅加入10 μmol/L LPA，对照组中加入无血清培养液，6 h后收集各组细胞总蛋白。通过Western blot显示SIN能够浓度依赖性下调LPA所诱导的Huh7细胞中C/EBPβ和COX-2蛋白表达水平(图3A)。用200、400 μmol/L的SIN分别预处理细胞1 h后加入10 μmol/L的LPA，继续培养6 h后提取细胞总RNA并行Real-time PCR检测C/EBPβ和COX-2 mRNA表达水平，继续培养24 h后行MTT检测细胞增殖。如图3B、C中所示，SIN浓度依赖性抑制LPA所诱导的人肝癌Huh7细胞C/EBPβ、COX-2 mRNA表达和增殖。

图2 LPA浓度依赖性上调人肝癌Huh7细胞的C/EBPβ和COX-2表达

3 讨论

自分泌运动因子(autotaxin, ATX)是能将底物溶血磷脂酰胆碱催化成为LPA的酶。ATX/LPA信号轴分泌及表达增加是多种恶性肿瘤发生发展过程中的重要步骤之一。研究表明，肝纤维化患者血中ATX和LPA水平升高，与丙肝、肝硬化的分期和并发症相关；肝癌患者血清LPA水平升高与肿瘤负荷相关。一些促炎细胞因子如TNF-α能够激活ATX/LPA信号通路，进而促进炎症相关的肝癌发生。此外，LPA激活p38丝裂原活化蛋白激酶和Rho/p160ROCK信号通路信号通路，促进肝癌细胞粘附、迁移和侵袭。一项关于肝癌中基质/肿瘤相互作用的研究表明，LPA由肝癌细胞旁分泌并促进成对瘤周组织成纤维细胞向癌相关成纤维细胞样表型的转化，从而诱导肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。总之，LPA直接参与了肝癌的发生发展。

图3 SIN浓度依赖性抑制LPA所上调的人肝癌Huh7细胞C/EBPβ、COX-2表达和增殖

COX-2可被包括LPA在内的多种生长因子、炎症因子诱导表达，其在肝癌组织中高表达，与肝癌的发生、发展和治疗效果密切相关。本研究证实LPA能够时间及浓度依赖性诱导人肝癌Huh7细胞COX-2的转录及翻译水平升高。COX-2基因的表达可被诸多转录因子如C/EBPβ调控，因其启动子区有这些转录因子的结合位点。C/EBPβ属于C/EBP转录因子家族成员之一，在其mRNA上有多个的开放读码框(ORF)和AUG起始密码子位点，能够翻译出3种不同的蛋白亚型，分别为38 ku的LAP*、35 ku的LAP以及20 ku的LIP。其中，2个LAP因同时含有N末端转录活性结构域、DNA结合结构域和C末端bZIP结构域而属于转录激活因子；LIP只含有DNA结合结构域和bZIP结构域而缺乏转录活性结构域，属于转录抑制因子，不具备转录活性。本研究显示，LPA能够时间-浓度依赖性升高人肝癌Huh7细胞C/EBPβ的mRNA转录和其2个LAP蛋白亚型的水平，进而上调COX-2表达、促进细胞增殖。有研究报道抗炎药物SIN能够通过抑制软骨细胞的炎症相关因子COX-2、iNOS、TNF-α和IL-6表达改善小鼠骨关节炎。本研究表明,SIN能够抑制人肝癌Huh7细胞中LPA所诱导的C/EBPβ、COX-2表达和细胞增殖。