干燥方式对脱水桑叶蛋白质组分的影响

王 溢，张 晖，陈 平，郭 微，廖柏勇

（仲恺农业工程学院园艺园林学院 广州510225）

桑叶为桑科落叶乔木桑树的叶，具有抗菌、抗氧化、降血糖等药用价值[1-2]。桑叶在中医药领域治疗糖尿病、关节炎和风湿病等人类疾病方面具有悠久的历史[3]。研究发现桑叶通过内皮细胞一氧化氮合成酶信号调节心血管系统[4]。桑叶的药用研究证明，桑叶在糖尿病治疗中具有显著的功效，可以通过调节磷脂酰肌醇-3 激酶和蛋白激酶B 信号通路中的基因表达来促进糖原异生和糖原合成[5-6]。

桑叶以其富含多糖、黄酮类、多酚和生物碱等活性物质而成为国家卫计委公布的“药食两用”植物资源[7-8]。桑叶药用成分检测和功能分析等相关研究已从桑叶乙醇提取物中纯化出桑叶多糖，并证明多糖是桑叶中的主要活性成分之一[8]。桑叶黄酮类物质具有清除自由基的作用，桑叶乙醇提取物的抗氧化活性高于桑椹和茎提取物[9-10]。对桑叶、茎皮、果实和根皮的甲醇提取物抗氧化活性和酚含量的比较研究表明，桑叶的抗氧化活性最高[11-12]。桑叶提取物中分离的多糖、总黄酮和生物碱类物质具有抑制糖苷酶活性的作用，生物碱类物质降血糖效果最佳[13-14]。

随着桑叶的药用和保健功能被深入挖掘，桑叶菜成为一种新型健康食品[15]。桑叶鲜销过程中易出现萎蔫、皱缩和发黄现象，品质与营养难以得到保证，同时，鲜叶供应受采摘时间和季节的限制，因此生产干制桑叶菜是延长保质期和保证品质的有效手段[15-16]。国内生产桑叶菜的工艺中常采用冷冻干燥和热风干燥的方式，其中冷冻干燥桑叶的叶绿素、酚类和多糖保留率较高，色泽较为鲜亮，叶片组织结构较为完整，烹饪后复水率可达93%[16]。通过扫描电镜观察热风干燥处理的桑叶，发现其细胞内部结构产生不可逆转的破坏、错位，导致细胞完整性丧失，组织结构塌陷[16]。为在桑叶的干燥过程中更多地保留活性成分和营养物质，本研究比较冷冻干燥技术与传统的热风干燥技术对蛋白质组分的影响，了解不同干燥技术的加工特性，为高品质桑叶菜生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器、设备

以粤椹大10 的夏季新鲜桑叶为原料，采摘顶芽以下3～5 位叶。将采摘的新鲜桑叶用去离子水冲洗5 min，滤纸吸取表面多余的水分，切成宽2 cm，长10 cm 的条形。

GHRH-100 型热泵干燥，广东省现代农业装备研究所；CZ-FD-27S 真空冷冻干燥机，上海程造仪器设备有限公司；5920R 低温离心机，德国Eppendorf 公司；Q-Exactive 质谱联用仪，美国Thermo Finnigan 公司；S22 分光光度计，上海棱光技术有限公司；PVDF 膜，美国默克公司；超敏化学发光检测试剂盒，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；WR0100 垂直电泳仪，美国伯乐公司。

1.2 桑叶的干燥处理

1.2.1 热风干燥称取桑叶20 g 平铺于托盘中，置于鼓风干燥箱中干燥。干燥条件设定为60℃、1.5 h，75℃、1 h，85℃、0.75 h。将干燥后的桑叶粉碎，储存于-80℃超低温冰箱。

1.2.2 冷冻干燥称取桑叶20 g 于-80℃超低温冰箱中冷冻24 h，将桑叶样品于真空冷冻干燥仪器中干燥24 h，温度设置为-40℃。将干燥后的桑叶粉碎，储存于-80℃超低温冰箱。

1.3 蛋白提取

每个样品称取1 g 叶片，采用三氯乙酸-丙酮法提取6 个样品总蛋白。热风干燥标记为RF-1、RF-2 和RF-3；冷冻干燥标记为LD-1、LD-2 和LD-3。蛋白质提取参照文献[17]和[18]的方法并作细微的调整，提取的蛋白质浓度参照Bradford法[19]测定。

1.4 叶片蛋白质样品酶解

在200 μg 蛋白质样品中加入DTT，使最终混合溶液中DTT 浓度为100 mmol/L。100℃水浴5 min。冷却后，混入200 μL UA 缓冲液（8 mol/L 尿素，150 mmol/L Tris‐HCl pH 8.0）。将混合样品转移至30 ku 超滤离心管中，11 000 r/min 离心20 min。混入200 μL UA 缓冲液重复离心，去滤液；加入100 μL 含有50 mmol/L IAA 的UA 缓冲液，振荡1 min。室温黑暗条件下反应30 min，随后11 000 r/min 离心20 min，重复此步骤2 次。加100 μL 碳酸氢铵缓冲液，以11 000 r/min 离心20 min，并重复此操作两次。加入40 μL 胰酶缓冲液，充分振荡，在37℃条件下酶解16～18 h。用新的无菌收集管收集离心后（11 000 r/min，20 min）的滤液，除盐后测量波长280 nm 处的OD 值。

1.5 LC-MS/MS 分析

根据酶解产物的浓度，从各样品酶解产物中取2 μg 上样。样品酶解产物通过毛细管高效液相色谱分离。分离梯度：0～100 min，B 液线性梯度从0%到45%；100～108 min，B 液线性梯度从45%到100%；108～120 min，B 液维持在100%。采用QExactive 质谱仪进行质谱分析。

1.6 Maxquant 非标记分析

将桑叶蛋白样品LC-MS/MS 原始数据导入Maxquant 软件（版本号1.3.0.5）进行数据库搜索，对各组原始数据进行鉴定和相对表达量的比较。本研究用数据库为mulberry_173773_20160518.fasta。

1.7 差异蛋白筛选及生物信息学分析

以冷冻干燥的蛋白质样品为对照，将热风干燥处理的蛋白质样品质谱非标记定量强度与冷冻干燥的蛋白质样品比较，以3 次生物学重复的平均值作为蛋白表达的差异倍率，两种干燥方式的差异蛋白筛选条件为P 值小于0.05，上、下调差异倍数在1.2 倍以上。如上、下调差异倍数小于1.2则认为该蛋白质表达量无差异。采用GO 数据库（http：//www.geneo-ntology.org/）和KEGG 通路数据 库（http：//www.genome.ad.jp/kegg/）对差异蛋白进行GO 功能注释和参与的代谢通路分析，获得差异蛋白质的分子功能、生物过程以及细胞组分等信息。

1.8 免疫印迹验证

将蛋白质组非标记定量分析中提取的蛋白质样品用于免疫印迹验证。将6 个样本蛋白质样品在浓缩胶电压80 V、分离胶电压120 V 条件下采用SDS-PAGE 方法分离。随后，将分离的蛋白样品转移到PVDF 膜，300 mA 电泳1 h。吸附有蛋白样品的PVDF 膜在TBS-T 溶液【0.2 mol/L Tris-HCl（pH 7.6），1.37 mol/L NaCl，0.1% Tween20】中洗5 min。清洗后的PVDF 膜在5% BSA 溶液（5 g BSA 溶于100 mL TBS-T 溶液）中封闭1 h，TBS-T 清洗5 min 后转入相应一抗中，室温震荡1～2 h。用TBS-T 清洗3 次，每次5 min，转入二抗中，室温震荡1 h。TBS-T 清洗后用超敏化学发光检测试剂盒进行反应，采用X 光片检测信号。

2 结果与分析

2.1 质谱鉴定结果

质谱数据采用Protein Pilot 5.0 软件在蛋白质组数据库检索，报告置信度在95%以上的蛋白质共4 292 个，差异蛋白为114 个，其中上调差异蛋白62 个，下调差异蛋白52 个。分析鉴定的蛋白质分布的理化性质，蛋白分子质量范围1.3～566.4 ku，等电点范围3.9～12.4（图1）。

图1 鉴定出的蛋白质等电点和分子质量分布Fig.1 Protein isoelectric point and mass distribution analysis of identified proteins

2.2 桑叶菜总蛋白质功能分类

本研究中，通过label-free 方法从两种加工方式的桑叶中鉴定出的总蛋白数为4 292 个。根据这些蛋白质的功能分类，涵盖了11 种分子功能，包括细胞发育过程（7%）、细胞质（2%）、能量代谢（10%）、细胞膜和物质转运（4%）、代谢过程（11%）、光合作用（13%）、蛋白质折叠转运和降解（2%）、蛋白质合成（7%）、信号转导（6%）和压力与防御（8%）（图2）。

图2 桑叶菜中鉴定的蛋白质功能分类Fig.2 Function classification of proteins identified in mulberry leaf vegetable

2.3 桑叶菜加工工艺对其蛋白质组分的影响

热风干燥与冷冻干燥的蛋白质组检测分别做3 次生物学重复，与冷冻干燥处理组相比，热风干燥处理的桑叶显著变化的蛋白质数量为114 个（表1）。以冷冻干燥处理组为对照，热风干燥处理的桑叶菜中62 个蛋白质含量下降，多于冷冻干燥处理方式。参照前人的研究[20-21]，对筛选出的差异蛋白质采用Cluster 聚类分析，将差异表达的蛋白质在不同样品中表达量的对数值以不同颜色在热图中展现（图3），聚类分析结果显示组内样本重复性较好。

表1 两种干燥方式的桑叶差异蛋白质列表Table 1 Differential proteins lists in mulberry leaves between two drying methods

2.4 桑叶菜差异蛋白质功能注释与分类

对两种加工方式的桑叶菜中筛选出的114 个差异蛋白质进行功能注释与分类。按照生物过程（Biological Process）、分 子 功 能（Molecular Function）和细胞组分（Cellular Component）将114 个差异蛋白质分为25 类，其中参与生物过程所占比例较高的前5 个是代谢过程（31.3%）、细胞过程（29.7%）、刺激响应（8.7%）、光合作用（3.9%）和生物合成过程调控（3.1%）；分子功能类别中所占比例较高的前5 个是催化活性占40.9%，蛋白质结合占32.9%，载体活性占3.5%，分子结构活性占3.3%，分子功能调节剂占3.1%。

2.5 免疫印迹验证

为了验证非标记定量蛋白鉴定结果的准确性，采用与非标记定量分析相同的蛋白样品进行免疫印迹验证分析。以新鲜桑叶的蛋白质样品为对照，选取葡聚糖内切-1，3-β-葡糖苷酶（W9RMX9，Glucan endo-1，3-beta-glucosidase）为目标蛋白，做免疫印迹分析。结果表明，蛋白质W9RMX9 的免疫印迹结果与非标记定量结果一致，表明非标记定量方法的可靠性，能够真实反映蛋白质表达丰度的变化情况。

（续表1）

（续表1）

3 讨论

本研究中鉴定肽段数为28 902，特异性肽段覆盖率为63.4%，特异性肽段匹配率高显示了非标记定量技术的灵敏性与准确性[21]。此外，鉴定出的蛋白质等电点（pI）介于3.9～12.4 之间，分子质量介于1.3～566.4 ku 范围，表明非标记定量技术不仅可以检测出极酸、极碱等极性蛋白质，还能够鉴定分子质量小于10 ku 或超大的蛋白质分子。采用免疫印迹法验证蛋白质组数据结果显示免疫印迹结果与蛋白质非标记定量结果一致，表明非标记定量方法应用于食品蛋白质组检测的可靠性。

桑叶加工会破坏叶片组织结构，导致营养物质降解。不同的干燥方法对桑叶菜品质的影响不同。从冷冻干燥的产品微观结构看，其细胞间冰晶的直接升华，使其空腔较大、较均匀一致，呈现出较好的蜂窝状结构，组织结构整体上较完整[22-23]。热风干燥呈层叠排列结构，细胞结构不规则，呈现不同大小的空腔，样品组织发生变形、皱缩[23]。本研究中，热风干燥处理的桑叶蛋白质发生显著的降解，114 个差异蛋白中，62 个在热风干燥处理过程中含量降低。通常，食品加工过程会导致蛋白质分子降解，尤其是大分子蛋白质降解为小分子蛋白质，而冷冻干燥中大分子蛋白质保留率较高。本研究中筛选到11 个分子质量超过80 ku 的蛋白质中有9 个大分子蛋白质在冷冻干燥处理组的含量显著高于热风干燥处理组，例如：谷氨酸合成酶（W9RLN4，Glutamate synthase[NADH]）、脂氧合酶（W9RJG5，Lipoxygenase）分子质量分别为196.8 ku 和100.5 ku，它们在冷冻干燥处理组中的含量分别是热风干燥处理组的1.42 和2.69 倍，表明冷冻干燥有利于大分子蛋白质的保留。

图3 两种干燥方式的桑叶差异蛋白质聚类分析Fig.3 Differential expression proteins clustering analysis of mulberry leaf vegetable with two drying methods

图4 桑叶菜两种加工方式的差异蛋白质功能分类Fig.4 Function classification of deferential proteins identified in mulberry leaf vegetable with two drying methods

图5 葡聚糖内切-1，3-β-葡糖苷酶的免疫印迹验证Fig.5 Western blotting analysis of glucan endo-1，3-beta-glucosidase

冷冻干燥食品由于在升华前先冻结，形成稳定的固体骨架，所以水分升华后，固体骨架基本保持不变，干制品不失原有的固体结构，保持着原有的形状[25]。研究证明，相对于热风干燥，冷冻干燥的桑叶品质最佳，热风干燥造成桑叶的叶绿素、酚类和蛋白质损失率较高[16]。本研究中，对两种加工方式的桑叶菜蛋白质组进行比较，发现叶绿体蛋白和细胞结构蛋白差异明显。例如：硫胺素噻唑合酶（叶绿体）（Thiamine thiazole synthase[chloroplastic]，W9S2E9）、细胞色素P450 704C1（Cytochrome P450 704C1，W9QS47）和微管蛋白（Tubulin beta）在热风干燥处理中含量显著下降，而这些蛋白质在冷冻干燥加工中较好地保留下来，与之前的研究冷冻干燥的桑叶菜皱缩不明显且颜色较鲜亮一致[16]。此外，热风干燥加工过程可能导致胁迫相关蛋白含量上升。例如：谷胱甘肽S-转移酶U17（Glutathione S-transferase U17，W9RBX4）与过氧化物酶（Peroxidase，W9RC94）在热风干燥处理中的含量显著高于冷冻干燥，它们主要参与细胞抗氧化，维持氧化平衡[24-25]。

4 结论

本研究基于非标记定量技术对不同干燥方式的桑叶菜蛋白质组进行鉴定及差异分析。结果表明，冷冻干燥处理的桑叶菜蛋白质结构较为完整且蛋白质大分子等营养物质保留率比热风干燥处理高，使从蛋白质分子角度鉴定桑叶菜产品的品质成为可能，并为优化桑叶菜加工方式奠定了理论基础。下一步将结合差异蛋白，分析桑叶菜活性成分。