乏氧诱导的miR-210表达通过BDNF/NF-κB/自噬信号途径促进成纤维细胞存活

刘琦 林峰

(上海市第八人民医院肿瘤科，上海 200235)

乏氧是一种细胞供氧不足的状态，发生在各种组织损伤中，包括缺血再灌注损伤、肺损伤、辐射诱导的正常组织损伤[1]。有研究报道，放射性后组织乏氧可加重放射性直肠损伤的发生[2]。乏氧可诱导活性氧(ROS)的产生，导致氧化应激，进而导致DNA、脂质和蛋白质损伤[3]。此外，ROS可激活氧化还原信号通路，导致内皮细胞死亡，诱导组织炎症和加重组织损伤[4]。然而，乏氧诱导细胞损伤的确切机制尚不清楚。microRNAs(miRNAs)是一种内源性、短的、非编码的RNA，能够结合靶基因mRNAs的3′-UTR，通过mRNA降解或抑制翻译在转录后水平抑制靶基因的表达[5]。有研究[6]表明miRNA-210可以通过下调乏氧条件下Bcl-2的表达降低结肠癌细胞的放射敏感性。本研究探讨乏氧条件下miR-210对成纤维细胞存活的影响。

1 材料与方法

1.1一般资料

1.1.1细胞系和培养条件 将人类皮肤成纤维细胞GM0639细胞在Dulbecco改良的Eagle′s培养基(法国Biowest)中培养。在三气培养箱(YCP-50S，长沙华西电子技术有限公司，中国)中于37°C，5%CO2，93%N2和2%O2的条件下进行乏氧处理。

1.1.2RNA分离和实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR) 使用TRIzol试剂(RNAprep Pure Cell/细菌试剂盒，天根，北京，中国)分离总RNA。miR-210逆转录引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTC AGCC-3′。所使用的实时PCR引物序列如下：miR-210 5′-CTGTGCGTGTGACAG-3′和miR-210反义序列，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和U6反义序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′; HIF-1α 5′-CGTTCCTTCGATCAGTTGTC-3′和HIF-1α反义序列，5′-TCAGTGGTGGCAGTGGTAGT-3′;BDNF5′-GAGCTGAGCGTGTGTGACAG-3′和BDNF反义序列5′-CTTATGAATCGCCAGCCAAT-3′。

1.1.3Western blot 用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(ThermoFisher，MA，USA)进行蛋白浓度定量。通过在10%(w/v)聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE分离等量的蛋白质提取物，然后转移到BioTraceNC膜(美国纽约州Pall)上。用封闭缓冲液(5%(w/v)牛血清白蛋白，0.1%(w/v)Tween 20磷酸盐缓冲液)封闭1 h。用于western blot的抗体如下：抗HIF-1α(Epitomics，CA，美国)，NF-κB/p-NF-κBp65(Epitomics)，抗LC3(Medical&Biological Laboratories Co.，Ltd.(日本)和抗BDNF(英国Abcam)，辣根过氧化物酶偶联的第二抗抗兔抗体(Millipore，MA，美国)或抗小鼠抗体(Genetex，TX，USA)。使用ECL印迹检测试剂(ThermoFisher)检测，并使用Chemioscope Mini系统(ChemiQ 4800 Bioshine，中国)进行成像。

1.2检测方法

1.2.1凋亡检测 PBS洗涤细胞两次，在37℃下离心5 min，并重悬于结合缓冲液中。然后，使用膜联蛋白V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BD Bioscience，NJ，美国)和碘化丙锭(BD Bioscience)对细胞染色。然后使用流式细胞仪(FC500 MPL，贝克曼库尔特，CA，美国)分析染色的细胞。

1.2.2ROS生成测定 将细胞在乏氧条件下培养24 h和48 h，然后与2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(20 mM)(DCF-DA； Beyotime Biotechnology，中国)在黑暗中孵育20 min。然后，将细胞悬液在室温下离心5 min，并除去上清液。使用流式细胞仪(FC500 MPL，Beckman Coulter)测量和计算DCF-DA的荧光强度，进行ROS检测。

1.2.3自噬检测 用PBS洗涤细胞两次，然后在37℃下离心5 min，并重悬于结合缓冲液中。使用Cyto-ID自噬检测试剂盒(美国，恩佐)对自噬体进行了染色。使用荧光显微镜(Eclipse Ti-S，Nikon，Japan)对细胞照相，并使用流式细胞仪(FC500 MPL，Beckman Coulter)检测荧光强度。

1.2.4siRNA转染 siRNA序列的合成(上海基因制药有限公司，中国)如下：miR-210 siRNA，5′-UCAGCCGCUGUCACACGCACAG-3′；HIF-1αsiRNA正义，5′-CCACCACUGAUGAAUUAAATT-3′和HIF-1α反义，5′-UUUAAUUCAUCAGUGGUGGTT-3′，BDNF siRNA正义，5′-GAGCGUGUGUGUGACAGUAUUTT-3′和BDNF反义，5′-AAUACUGUCACACAC′。将细胞铺板24 h，然后使用X-tremeGene siRNA试剂(Roche)将miR-210 siRNA，HIF-1αsiRNA或BDNF siRNA转染。

1.2.5细胞内GSH/GSSG水平检测 将细胞在6孔板中铺板24 h，将细胞用冷PBS洗涤一次。使用GSH和GSSG测定试剂盒(中国Beyotime)进行细胞内GSH/GSSG水平检测。

2 结 果

2.1乏氧对细胞凋亡，ROS产生和自噬的影响 与正常氧条件下(21%O2)相比，乏氧处理(2%O2)下的细胞凋亡(图1A)，ROS产生(图1B)和自噬体形成(图1C，1D)显着增加。这些作用是时间依赖性的。

图1 乏氧对细胞凋亡、ROS生成及自噬的影响

2.2乏氧处理下HIF-1α和miR-210的表达 与正常氧条件下相比，乏氧处理超过12 h后，HIF-1α和miR-210显着增加(图2A-C)。在乏氧下，用HIF-1αsiRNA转染后，miR-210的表达显着降低(图2D，E)。这些提示miR-210是HIF-1α的下游靶标。

图2 乏氧条件下HIF-1α与miR-210的关系

2.3miR-210对ROS产生，细胞凋亡和GSH/GSSG水平的影响 在乏氧条件下，与对照组细胞相比，miR-210干扰后表达水平降低的细胞的细胞凋亡和ROS水平显著增加(图3A-C)。此外，在乏氧条件下，miR-210的干扰可显着降低GSH / GSSG水平(图3D)。

图3 乏氧条件下miR-210对ROS生成、GSH/GSSG和细胞凋亡的影响

2.4miR-210，BDNF，NF-κB与自噬之间的关系 miR-210与BDNF的3′UTR内的高度保守序列结合(图4A)。 在miR-210受到siRNA干扰后，BDNF mRNA和蛋白表达均增加(图4B，4C)。此外，p-NF-κB p65随着BDNF的干扰而增加(图4D)。当BAY11-7082(10μM，24 h)抑制p-NF-κBp65时，LC3-II和LC3-I的比例从3.2降低到1.9(图4E)。提示miR-210可能通过BDNF /NF-κB途径影响自噬。

图4 miR-210、BDNF、NF-κB与自噬的关系

3 讨 论

乏氧的发生会导致许多病理状况产生,它会对细胞和组织的生物学功能产生不利影响，伤口和组织重塑会导致脉管系统的破坏和受损组织内氧气的供应减少，进而引起乏氧状态[7]。研究证实乏氧是加重缺血再灌注[8]，中风[9]和放射[10]引起的组织损伤的诱导剂。乏氧会导致ROS水平的升高，包括过氧化物，超氧化物，羟基自由基等，这些都是由NADPH氧化酶和黄嘌呤氧化酶调节的[11]。研究发现乏氧下HIF-1α表达增加，随后刺激ROS形成, ROS形成的增加促进FoxO3a的活性，然后通过增加Bim和Bax并降低Bcl-xL和Bcl-2来诱导凋亡[12]。已发现MiRNA与多种生物学过程有关，包括细胞增殖，分化，凋亡和血管生成[13]。既往研究表明，包括miR-210在内的几种miRNA对乏氧都有反应。既往研究已证实miR-210在细胞周期调控和DNA损伤中起作用[14]。 miR-210过表达诱导的ROS的产生与凋亡有关。在癌症中，已证明miR-210在神经母细胞瘤，肺腺癌，肾细胞癌，食管鳞状细胞癌和肺腺癌中以促凋亡的方式起作用[15]。

BDNF可以通过调节中枢神经系统来保护心脏，并通过募集内皮细胞来促进缺血组织的新生血管形成[16]。BDNF可以结合原肌球蛋白相关的激酶B(TrkB)。 BDNF-TrkB的结合促进了促分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ ERK)，磷脂酶Cγ(PLCγ)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路的激活[17]。进一步的研究表明，BDNF /原肌球蛋白相关激酶B(TrkB)通路通过增加Bcl-2表达并抑制caspase-3活性，进而具有抗缺血凋亡的作用[18]。已知有几种miRNA会影响BDNF表达的转录后控制，包括miR-16，miR-22，miR-195和miR-210[19]。研究已发现miR-210通过靶向BDNF来调节局部麻醉诱导的脊髓神经毒性和背根神经节(DRG)神经毒性。此外，BDNF抑制作用可以逆转miR-210下调对布比卡因诱发的DRG神经毒性的保护作用[20]。本研究中我们发现miR-210是HIF-1α的下游靶标，并且在乏氧条件下被上调，这与既往研究一致。在成纤维细胞中，miR-210的表达下调可导致BDNF表达升高。

核因子(B(NF-κB)是一种转录因子，已有研究发现在调节与先天和适应性免疫反应，炎症反应，应激，细胞存活，细胞增殖和细胞损伤有关的基因的表达中起着核心作用。 NF-κB是五个亚基的二聚体，如RelA(p65)，RelB，c-Rel，NF-κB1(p50)和NF-κB2(p52)，其中最丰富且普遍存在的是p50-p65异二聚体。通过与IκB抑制蛋白的成员相互作用，它以潜在形式存在于细胞质中。 NF-κB可以通过破坏与IκB的相互作用激活。释放的NF-κB易位至细胞核，然后与靶基因的启动子和增强子区域的κB元素结合，导致基因表达受抑制[21]。研究表明，BDNF也可以激活NF-κB。另外，BDNF可以通过抑制海马神经元中的NF-κB信号传导来刺激白介素-1β(IL-1β)[22]。这些提示NF-κB是BDNF和自噬之间的一种可能的介质。本研究还发现，BDNF下调会增加p-NF-κBp65的表达，而p-NF-κB受抑制会导致自噬水平降低。这些表明NF-κBp65的表达可能与BDNF和自噬密切相关。

综上，我们的研究发现乏氧/HIF/miR-210在乏氧条件下的细胞存活中起着重要作用。miR-210影响细胞存活的机制与BDNF/NF-κB/自噬信号通路密切相关。它可能为乏氧相关的组织损伤提供潜在的治疗方法。