山丹丹愈伤组织分化培养研究

常 裕，何亚蓉，王凯琪，齐向英

(延安大学 生命科学学院，陕西 延安 716000)

山丹丹学名山丹(Liliumpumilum.DC)为百合科百合属多年生草本植物[1]。山丹丹是延安市市花，不仅可以作观景花卉，还有许多药用价值。关于山丹丹的组织培养，国内有不少的研究者开展了大量的工作。以山丹丹的鳞片为材料的研究结果表明，山丹丹鳞片在不同浓度的IBA和NAA浓度组合中明显表示出不同的适应性[2]。王凯[3]等以南泥湾野生山丹丹鳞茎为材料建立野生山丹丹快繁和植株再生系统。但目前国内对山丹丹外植体诱导出的愈伤组织分化研究尚未见报道。本研究通过对山丹丹愈伤组织经过继代培养后，再进行分化培养，研究山丹丹愈伤组织分化成植株的可能性。

1 实验部分

1.1 材料

实验用材料为延安地区野生山丹丹鳞片诱导形成的愈伤组织，由延安市宝塔区山丹生物科技有限公司提供，保存于陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心。

1.2 实验方法

1.2.1 继代培养

将山丹丹愈伤组织在无菌条件下用镊子夹碎成0.5 cm×0.5 cm的小方块，接入到继代培养基MS+6-BA 0.8 mg/L+IBA 0.2 mg/L+TDZ 0.01 mg/L+蔗糖25 g/L，pH=6.8。每瓶5小块愈伤组织，于25℃光照条件下培养20 d。

1.2.2 分化培养

分化培养基设计采用3因素3水平正交实验进行(表1)，所有培养基添加蔗糖25 g/L，pH=6.8。在无菌条件下将继代培养20 d的愈伤组织再次用镊子夹碎成0.5 cm×0.5 cm的小方块转接在分化培养基中。每个处理组合接种20瓶，每瓶接种5块，每个处理共计100块。接种后在散光条件下培养7 d然后转入光培养。以继代培养为对照组。

表1 因素水平表

1.3 培养条件

培养室温度控制在24±2℃，光照强度为1500±200 lx，光照时间12 h/d，相对湿度为60%～75%。

1.4 统计与分析

散光培养结束后，每周观察1次，统计分化情况，以每块愈伤组织分化出2个及2个以上芽体确定为分化，统计计数为1，分化出2个以下芽体统计计数为0.5。在第28 d时结束统计，并以第28 d统计结果做实验分析。

分化率=已分化愈伤组织块数/总接种愈伤组织块数×100%。

2 结果与分析

山丹丹愈伤组织接种在分化培养基中3 d后，愈伤组织开始有部分变成绿色。经过7 d培养愈伤组织明显增大，14 d左右有部分愈伤组织的侧面开始逐渐褐化，在培养的第19 d从褐化部位中间开始分化出芽体(见图1)，这时的芽体表现为细小的叶片。第28 d时每1个处理组合中均不同程度的分化出小芽体。分化出芽体的数量各不相同，最多的一块愈伤组织上分化出12个小叶片。

图1 分化出芽体的愈伤组织

对统计结果计算分析，计算分化率见表2。在所有培养基组合中F1：MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+TDZ 0 mg/L中分化率达到了72.72%。确定为本研究的最佳培养基。由于TDZ在该培养基中并没有添加，所以最终确定为MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖25 g/L，pH=6.8。

表2 28 d后愈伤组织分化培养结果

经过极差分析发现，RTDZ=21.74、R6-BA=15.45、RIBA=11.59，说明在该正交设计中对愈伤组织分化的影响大小依次为TDZ>6-BA>IBA。但从整个分化培养的结果来看，随着TDZ浓度的增大，愈伤组织的分化率一直呈现出降低的趋势，说明山丹丹愈伤组织分化培养中TDZ是非必须的外源激素。以6-BA作为单个因子统计结果显示，TDZ 0水平是F1(72.72)>F6(51.85)>F8(42.86)。经过极差分析整个分化过程随着6-BA浓度的增加分化率呈下降趋势。以IBA作为单个因子统计结果显示，随着IBA浓度的增加分化率呈先下降后升高。

3 讨论

外源激素在百合愈伤组织分化培养中起到关键性作用。在东方百合“bernini”花蕾的研究表明，诱导其愈伤组织分化的最佳分化培养基为MS+KT 0.1 mg/L+BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L[4]。东方百合元帅“Acapulco”、提拔“Tiber”和西伯利亚“Siberia”研究结果显示，幼叶的胚性愈伤组织在MS+BA 1.0 mg/L+KT 0.1 mg/L+IBA 0.1 mg/L的培养基上能高频再生出芽，而花丝的胚性愈伤组织在MS+BA 1.5 mg/L+KT 0.3 mg/L+IBA 0.2 mg/L的培养基上能高频再生出芽[5]。以“索邦”百合鳞茎为材料诱导愈伤组织并分化的研究显示，1/2MS+2.4-D 2.0 mg/L适合其植株再生[6]。这几种百合都属于大花百合，一般为园艺栽培种，由于愈伤组织的起始材料不相同，在分化培养中使用的激素种类和浓度也有所不同。本研究中山丹丹属于野生百合，研究结果和这些百合存在差异。相同点是这些百合愈伤组织分化过程中使用的激素在山丹丹愈伤组织分化培养中也能表现出分化的特征，只是效果有所差异。

在我国野生百合淡黄花百合上的研究发现，以珠芽为材料可以在MS+TDZ 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2.4-D 1.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L的培养基上，实现一次性诱导愈伤组织和分化小芽体[7]。同样的研究结果在绿花百合以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2.4-D 0.1 mg/L的培养基中也有表现[8]。这些研究为山丹丹从鳞片或者其它外植体一次性诱导形成芽体提供了思路。宜兴百合的研究在MS+NAA 0.15 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 0.01～0.1 mg/L的分化培养基[9]和宜昌百合在MS+TDZ 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+2，4-D 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L的分化培养基上都比较适合诱导小芽体[10]，同时在这两个研究中均表现出褐化的现象，也出现了褐化后仍旧能分化出小芽体的现象，这和本研究十分相似。麝香百合以MS+2.4-D 2.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L培养基诱导效果最佳[11]，这种培养基处理的愈伤组织连续培养8年都可成功获得完整植株。