芪防颗粒薄层色谱供试品溶液制备的优化

王迎阳

(铜川市食品药品检验检测中心，陕西 铜川 727031)

芪防颗粒由黄芪、防风、白术、百合等中药材配伍制成，益气固表、滋阴润肺。临床上用于感冒、流感等的治疗以及病毒性肺炎包括新冠肺炎、SARS等的预防。黄芪是芪防颗粒处方中重要的一味药，且黄芪中的化学成分繁多，其中皂苷类成分(AMS)是重要的药效成分，具有增强机体免疫力、提高机体的抗病能力抗病毒作用[1]。黄芪甲苷是AMS主要的有效成分，含量相对最高，在《美国药典》《欧洲药典》《香港中药材标准》中黄芪甲苷常作为黄芪的定性定量指标，是一切标准制定的基础。《芪防颗粒质量标准》鉴别中黄芪甲苷项下供试品溶液的制备采用回流和液-液萃取，步骤多，易造成黄芪甲苷的流失，在检验结果上容易造成误判，且耗时长，不利于快速检测。本文参考梁曜华等[2]连续单因素法优化黄芪中黄芪甲苷的含量测定方法和药品质量标准分析方法验证指导原则[3]，列举出能够影响黄芪甲苷提取效率的3个主要因素[4-6]。通过对3个因素的枚举验证和方法学考察，使供试品溶液的制备方法得到优化且能做到快速鉴别。

1 材料

1.1 仪器

CAMAG LINOMAT5自动点样器(瑞士卡玛公司)；ME204T型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；MS105型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH-2型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；DHG-9203AD型电热恒温鼓风干燥器(上海齐欣科学仪器有限公司)；TH-II型薄层加热器(上海科哲生化科技有限公司)；紫外观察箱(瑞士卡玛公司)。

1.2 试剂

黄芪甲苷对照品(CAS No.84687-43-4，批号110781-201616，HPLCV级，含量97.4%)购于中国食品药品检定研究院；甲醇、正丁醇、氨水为分析纯；娃哈哈纯净水；硅胶G薄层板(青岛海洋化工分厂)。

芪防颗粒(批号200420)由铜川市矿务局中心医院提供；自制阴性对照按《芪防颗粒质量标准》中处方除去生黄芪后按制法制成阴性对照清膏。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

按照《中国药典》2015年版四部薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液为展开剂。

2.2 溶液的制备

取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.63 mg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液制备过程的优化主要考虑了可能影响芪防颗粒中黄芪甲苷提取效率的3个主要因素：①提取方式;②是否用正丁醇萃取；③氨试液加入时机，进行枚举，供试品溶液制备方法枚举示意见图1。

图1 供试液制备方法的枚举示意图

方法A(《芪防颗粒质量标准》方法)：取样品15 g研细，精密加入甲醇100 mL，加热回流2 h，放冷，摇匀，滤过，精密量取续滤液50 mL，蒸干，残渣加水10 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇提取液，用氨试液充分洗涤3次，每次40 mL，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解，并转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

方法B：取样品15 g研细，精密加入甲醇100 mL，加热回流2 h，放冷，摇匀，滤过，精密量取续滤液50 mL，蒸干，残渣加氨试液15 mL，蒸干，残渣用甲醇溶解，并转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

方法C(碱液直接提取)：取样品15 g研细，精密加入甲醇-氨试液(4∶1)100 mL，加热回流2 h，除不用氨试液洗涤外后续步骤与方法A一致。

方法D：取样品15 g研细，精密加入甲醇-氨试液(4∶1)100 mL，加热回流2 h，除不用氨试液洗涤外后续步骤与方法B一致。

方法E、方法F、方法G、方法H操作分别对应方法A、方法B、方法C、方法D，将加热回流2 h变为超声(250 W，40 KHz)30 min。

2.3 制备方法的优选

取芪防颗粒研细，分别按上述8种制备方法制备供试品溶液，与对照品溶液分别点样在同一硅胶G薄层板上，按照色谱条件进行展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，置薄层加热板上于105℃加热至显色清晰，置紫外观察箱(365 nm)下检视，样品色谱与对照品色谱主斑点位置统一，结果见图2。

S为黄芪甲苷对照品色谱；1～8为方法A～H制备供试品溶液色谱

通过对图2中A和E、B和F、C和G、D和H色谱图的比较，发现超声法的主斑点较回流法更明显；通过对图2中A和C、B和D、E和G、F和H色谱图的比较，发现甲醇-氨试液(4∶1)提取的主斑点较氨试液洗涤更明显；通过对图2中A和B、C和D、E和F、G和H色谱图的比较，不用正丁醇萃取的主斑点较用正丁醇萃取更明显。

方法A～H这8种方法从供试品的制备至得到结果耗时分别为5 h、3 h、4 h、2.5 h、3 h、2 h、2.5 h和1.5 h。

通过对比主斑点显色情况和制备耗时的分析，优选出方法H进行供试品溶液的制备。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验

取自制阴性对照清膏2份置于250 mL锥形瓶中，第一份50 mL，第二份30 mL，在第一份中加入黄芪甲苷对照品3 mg，按照方法H制备阴性对照加标溶液、阴性对照溶液。按色谱条件，吸取供试品溶液、阴性对照加标溶液、阴性对照溶液和黄芪甲苷对照品溶液分别点于同一硅胶G薄层板上展开，并显色。结果显示其他成分对黄芪甲苷的测定无明显干扰(见图3)。

S为黄芪甲苷对照品色谱；1为阴性加标对照溶液色谱；2为供试品溶液色谱；3为阴性对照溶液色谱

2.4.2 耐用性实验

按色谱条件，将方法H制备的供试品溶液和黄芪甲苷对照品溶液分别点于同一块硅胶G薄层板上，在3℃和35℃下展开，结果表明温度的变化对黄芪甲苷的测定无明显干扰(见图4)。

S为黄芪甲苷对照品色谱；1为供试品溶液色谱

2.4.3 重复性实验

取同一批次芪防颗粒，平行5份，每份15 g，分别制成供试品溶液，与黄芪甲苷对照品溶液的点于同一硅胶G薄层板上，按色谱条件进行展开，结果显示5份平行样本结果一致(见图5)。

S为黄芪甲苷对照品色谱；1～5为平行供试品溶液色谱

3 结论

(1)通过8种制备方法对应薄层色谱图的比较，优化后的方法H显色更清晰，能更加准确地判断样品中是否含有黄芪甲苷，可用于芪防颗粒的定性分析。耗时由5 h缩短为1.5 h，可用于新冠疫情防控的药品的检验，检验时间的缩短有利于药品快速投放市场。

(2)优化后的供试品溶液的制备方法具有良好的专属性、耐用性、重复性，且简单易行，适合大量样本的检测。可为其他黄芪甲苷含量较低中成药的质量控制提供参考。