海洋Arthrobacter protophormiae CDA2-2-2 产几丁质脱乙酰酶发酵条件优化

张晓彤，张晓萌，苏永成，武波飞，刘 姝，卢 静，杨 光，房耀维

（江苏海洋大学食品科学与工程学院，江苏连云港 222000）

几丁质普遍存在于无脊椎动物的外骨骼和角质层，也是构成大多数真菌细胞壁的主要成分[1]。全球水产品有机体中约8%富含几丁质（约占干重的8%～55%），包括虾、蟹、鱿鱼、蚝和墨鱼等[2-3]。仅在水生生态系统，几丁质每年的产量就超过1011吨[4]。在生物体中，几丁质常与其它结构物质交联，在真菌细胞壁中与β-葡萄糖共价结合，在昆虫等动物中与特定的蛋白质交联，形成各种有序结构[5-6]。

几丁质是自然界中总量仅次于纤维素的天然多糖和可再生聚合物。几丁质的高结晶度导致其应用受到极大限制[7]。壳聚糖是几丁质分子中乙酰基被部分或全部脱除后的产物，因其分子中有大量游离的氨基，故其溶解性能相比几丁质得到很大改善，并具有生物可降解性，广泛用于食品、医药、轻工、印染、环保和农业等领域，具有很大的开发和推广潜力[8-9]。

目前，工业上制备壳聚糖的方法主要是化学法，即使用浓碱热解几丁质脱除乙酰基，容易导致严重的环境污染问题，且获得的壳聚糖产品中乙酰基的脱除程度不一致，产品均一性差[10]。酶法生产壳聚糖作为一种新型绿色环保的脱乙酰方法，反应条件温和，能耗值相对较低，污染小，可获得脱乙酰程度均一稳定的产品[11]。因此，运用几丁质脱乙酰酶生产壳聚糖成为极具潜力的生产方式[12]。目前国内外报道的几丁质脱乙酰酶产生菌多为真菌，包括Aspergillus nidulans[13]、Schizosaccharomyces pombe[14]、Puccinia graminis[15]、Fusarium proliferatum[16]等。这些菌株发酵产酶水平较低，催化温度较高。

海洋具有低温、高盐、寡营养等独特多样的生态环境，蕴含了丰富的能够产生新颖催化特性酶类的微生物资源。针对目前产几丁质脱乙酰酶微生物菌株发酵水平较低，催化温度高等问题。本研究组从连云港高公岛海域海泥样品中筛选获得一株低温几丁质脱乙酰酶细菌Arthrobacter protophormiaeCDA2-2-2。本研究对该菌株发酵产几丁质脱乙酰酶的发酵条件进行优化，提高发酵产酶水平，为工业化酶法催化几丁质脱乙酰制备壳聚糖提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

几丁质 澳新生物工程有限公司；蛋白胨、酵母粉、对硝基-N-乙酰苯胺、K2HPO4、KH2PO4、NaCl、NH4SO4等试剂均为分析纯 上海博微生物科技有限公司；种子培养基（酵母粉0.1%，蛋白胨0.5%，NaCl 1%，陈海水配制，pH7.0）、2216E 培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，FePO40.01%，琼脂2%，陈海水配制，pH7.0）、发酵培养基（几丁质0.5%，酵母粉1%，葡萄糖0.5%，MgSO40.01%，K2HPO40.1%，KH2PO40.03%，陈海水配制，pH7.0）实验室自制；陈海水 取天然海水，室温静止两周后纱布过滤。

高速冷冻离心机 美国SIGMA 公司；分光光度计 杭州明基科学仪器有限公司；SPX-250B-2 生化培养箱 上海博迅实业有限公司；DK-8D 电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司；Nikon 90i 全电动显微镜 上海普赫光电科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 粗酶液的制备 将保存于超低温冰箱里的甘油菌株接到2216E 培养基平板，28 ℃培养过夜，接种于种子培养基中，28 ℃，140 r/min 摇床培养1 d 后培养得种子培养液，按2%接种量接种到发酵培养基，于不同发酵条件下发酵后，8000×g 离心10 min，上清液过22 μm 滤膜，即为粗酶液[17]。

1.2.2 酶活的测定 根据Chai 等报道的方法制备对硝基乙酰苯胺标准曲线[10]。试管中加入30 ℃预保温的0.05 mol/L pH7.0 磷酸缓冲液3 mL，200 mg/L的对硝基乙酰苯胺水溶液1 mL，粗酶液1 mL，于30 ℃水浴反应15 min，沸水浴终止酶促反应，12000 r/min离心10 min，测定上清液的吸光度（A400)。以添加1 mL 同样浓度沸水浴灭活15 min 的酶液为对照。酶活单位（U）定义：在上述反应条件下每小时产生对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个酶活力单位[18]。

相对酶活：单因素变量产生的最高酶活为100%，其他因素产生的酶活占最高酶活的比例即为相对酶活（%）。

1.2.3 单因素优化发酵产酶条件

1.2.3.1 培养基成分对菌株发酵产酶的影响 发酵条件：以3%接种量将种子液接种至发酵培养基，以pH7.0、装液量30%、30 ℃、180 r/min 发酵48 h 为基本条件，进行几丁质脱乙酰酶的酶活测定。

碳源的确定：分别添加1%的葡萄糖、乳糖、蔗糖、白砂糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、藕粉。

氮源的确定：分别添加1%的氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、豆粕、米糠、麸皮、黄豆粉、酵母粉。

无机盐的确定：分别添加0.015%的KCl、ZnCl2、CaCl2、FeSO4、CuSO4、CoCl2、MgSO4、MnSO4，考察无机盐对菌株发酵产几丁质脱乙酰酶的影响。

1.2.3.2 发酵条件对菌株产酶的影响 发酵培养方法：以3%接种量将种子液接种至发酵培养基，以pH7.0、装液量30%、30 ℃、180 r/min 发酵48 h 为基本条件，进行几丁质脱乙酰酶的酶活测定。分别对发酵温度、发酵时间、装液量、初始pH、转速进行单因素优化。接种量：0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%；装液量：20%、30%、40%、50%、60%；发酵温度：20、25、30、35、40、45、50 ℃；初始pH：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0；转速：100、120、140、160、180、200 r/min；发酵时间：12、24、36、60、72、84、96、108、120 h。

1.2.4 PB 试验 在单因素实验的基础上，选择葡萄糖、黄豆粉、MgSO4、发酵时间、发酵温度、培养基初始PH、装液量、接种量、转速为考察因素，每个因素设计了高（1）低（-1）2 个水平（表1），运用Design-Expert V8.0.6 软件进行12 次PB 试验设计，分别对9 个因素进行数据分析，确定影响相对酶活大小的显著性因素[19]。

表1 Plackett-Burman 试验因素水平表Table 1 Test factor level of Plackett-Burman

1.2.5 最陡爬坡实验 在单因素优化实验和PB 试验的基础上，对发酵水平影响显著的3 个因子，选定基础发酵条件，根据PB 试验中t 值选定效应方向，设定一定步长，进行最陡爬坡试验[20]。

1.2.6 响应面法优化发酵产酶条件 根据单因素实验和PB 试验结果，确定具有显著性的3 因素为变量，以酶活大小为响应值，运用Design of Experiments设计3 因素3 水平共17 个试验点的Box-Behnken响应面分析试验，因素水平表见表2。根据最陡爬坡试验选择因素水平。响应面发采用多远二次方程来拟合因素和响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优实验因素，并对模型进行验证，以得到菌株的最优发酵条件[21]。

表2 Box-Behnken 试验因素水平表Table 2 Test factor level of Box-Behnken

1.2.7 数据处理 每组实验设3 组平行，重复实验3 次，实验结果用平均值±标准方差（n=3）表示，使用Origin2018 作图，PB 试验和响应面采用Design Expert 10 进行数据分析[21]。

2 结果与分析

2.1 对硝基苯胺的标准曲线

对硝基苯胺标准曲线如图1 所示，该图所得线性方程为y=0.0556x+0.00467。该方程决定系数为0.9997，契合度高。

图1 对硝基苯胺标准曲线Fig.1 Standard curve of p-nitroaniline

2.2 发酵产几丁质脱乙酰酶条件单因素优化

2.2.1 碳源对菌株CDA2-2-2 产酶的影响 碳源对CDA2-2-2 产酶的影响如图2。碳源为葡萄糖时相对酶活最大，为5.33 U/mL。可溶性淀粉、蔗糖和乳糖的相对酶活在75%以上，玉米淀粉和木薯淀粉的相对酶活较低，因此确定碳源为葡萄糖。前期研究发现，Arthrobacter protophormiaeCDA2-2-2 所产几丁质脱乙酰化酶为非诱导酶，即添加几丁质并不能增加发酵产酶水平，且几丁质不溶于水，作为碳源发酵水平较低，因此在碳源优化中没有添加几丁质[17,22]。

图2 碳源对菌株CDA2-2-2 产酶的影响图Fig.2 Effect of carbon source on enzyme production of strain CDA2-2-2

2.2.2 氮源对菌株CDA2-2-2 产酶的影响 氮源对CDA2-2-2 产酶的影响如图3。氮源为酵母粉时酶活产酶水平最高，为5.37 U/mL，黄豆粉和豆粕为氮源时产酶水平达到最高水平的97%和80%，硝酸铵、硫酸铵为氮源时产酶水平较低，可能是无机氮营养单一，而有机氮源富含微生物活动必需的生物因子和微量元素，在生长过程中更易被生物吸收利用或对几丁质脱乙酰酶本身具有激活作用[9]。由于酵母粉价格昂贵，综合考虑成本和产酶量，选择黄豆粉为氮源进行后续优化研究。

图3 氮源对菌株CDA2-2-2 产酶的影响图Fig.3 Effect of nitrogen source on enzyme production of strain CDA2-2-2

2.2.3 无机盐对菌株CDA2-2-2 产酶的影响 无机盐对CDA2-2-2 产酶的影响如图4。无机盐为MgSO4时相对酶活最大为5.28 U/mL，而MnSO4、CoCl2、CuSO4、FeSO4、KCl 的相对酶活在60%以下，因此无机盐确定为MgSO4。金属离子通过影响菌株生长、酶的分泌，以及酶活性从而影响微生物发酵产酶水平[7]。

图4 金属离子对菌株CDA2-2-2 产酶的影响图Fig.4 Effect of inorganic salt on enzyme production of strain CDA2-2-2

2.2.4 接种量对菌株CDA2-2-2 产酶的影响 接种量对菌株CDA2-2-2 发酵产酶的影响如图5。随着接种量的增加，酶活变大，到2%时产酶最高，最高酶活为5.33 U/mL。接种量大于2%后酶活逐渐变小，因此确定接种量为2%。接种量通过影响发酵菌株的延迟期，接种量过小，延迟期增长，不利于产酶[12]。

图5 接种量对菌株CDA2-2-2 发酵产酶的影响图Fig.5 Effect of inoculum size on enzyme production of strain CDA2-2-2

2.2.5 装液量对菌株CDA2-2-2 产酶的影响 装液量对菌株CDA2-2-2 发酵产酶的影响如图6。装液量30%～40%时产酶较高，装液量高于40%时，酶活快速下降。装液量为40%时相对酶活最高，为5.35 U/mL，因此装液量确定为40%。装液量较少时，产酶水平较高，随着装液量增加，溶氧量降低，降低菌株生长及产酶水平[12]。

图6 装液量对菌株CDA2-2-2 发酵产酶的影响图Fig.6 Effect of loaded volume on enzyme production of strain CDA-2-2-2

2.2.6 发酵温度对菌株CDA2-2-2 产酶的影响 发酵温度对菌株CDA2-2-2 发酵产酶的影响如图7。产酶水平从20 ℃开始随温度的升高而增大，在30～35 ℃内酶活较高，当发酵温度超过35 ℃时，酶活开始迅速下降。35 ℃时产酶最高，酶活为5.435 U/mL，因此发酵温度确定为35 ℃。温度影响微生物生长及代谢，同时影响酶活性，因此对菌株发酵产酶有明显影响[23]。

图7 发酵温度对菌株CDA2-2-2 发酵产酶的影响图Fig.7 Effect of fermentation temperature on enzyme production of strain CDA-2-2-2

2.2.7 培养基初始pH 对菌株CDA2-2-2 产酶的影响 培养基初始pH 对菌株CDA2-2-2 发酵产酶的影响如图8。培养基的初始pH 为5.0 或8.0 时，相对酶活较低。但在pH6.5～7.5 时，酶活较高，保持90%以上的酶活。pH 为7.0 时产酶最高，最高酶活为5.41 U/mL，因此初始pH 确定为7.0。

图8 培养基初始pH 对菌株CDA2-2-2 发酵产酶的影响图Fig.8 Effect of initial pH on enzyme production of strain CDA-2-2-2

2.2.8 转速对菌株CDA2-2-2 产酶的影响 转速对菌株CDA2-2-2 发酵产酶的影响如图9。当转速为100 r/min 时产酶较低，转速为140 r/min 时产酶最高，相对酶活为5.45 U/mL。当转速140 r/min 以上后，酶活开始迅速下降，因此转速确定为140 r/min。转速影响三角瓶内的溶氧，从而影响菌株的生长和发酵产酶水平[12]。

图9 转速对菌株CDA2-2-2 发酵产酶的影响Fig.9 Effect of the speed of centrifugal on enzyme production of strain CDA-2-2-2

2.2.9 发酵时间对菌株CDA2-2-2 产酶的影响 发酵时间对菌株CDA2-2-2 发酵产酶的影响如图10。随着发酵时间的进一步增加，相对酶活先上升后呈下降趋势。发酵时间84 h 产酶最高，最高酶活为5.61 U/mL，因此发酵时间确定为84 h。

图10 发酵时间对菌株CDA2-2-2 发酵产酶的影响Fig.10 Effect of ferrnentation time on enzyme production of strain CDA-2-2-2

2.3 PB 试验设计优选影响酶活大小的显著因素

在单因素实验的基础上，选择葡萄糖、黄豆粉、MgSO4、发酵时间、发酵温度、培养基初始pH、装液量、接种量、转速为考察因素，每个因素设计了高（1）低（-1）2 个水平（表1），运用Design-Expert V8.0.6软件进行12 次PB 试验设计（见表3），分别对9 个因素进行数据分析，确定影响相对酶活大小的显著性因素[22]。

表3 Plackett-Burman 试验设计与结果Table 3 Plackett-Burman experimental design and results

运用Design-Expert V8.0.6 软件对表3 中数据进行显著性试验，结果见表4。由表4 可知，MgSO4、发酵温度、葡萄糖对相对酶活大小影响均显著，且显著性大小排序为MgSO4（X3）＞发酵温度（X5）＞葡萄糖（X1）；其他因素对相对酶活大小的影响不显著。因此选择MgSO4（X3）、发酵温度（X5）、葡萄糖（X1）作为响应面模型的考察因素。

表4 Plackett-Burman 试验设计方差分析Table 4 Plackett-Burman analysis of variance of test design

2.4 最陡爬坡实验结果分析

Plackett-Burman 实验可以选择出对发酵水平影响显著的因子，但是不能预测变量的最佳水平，因此，设计最陡爬坡实验，以确定重要因素的最佳水平领域[24]。实验结果见表5。3 个重要因素在第2 组水平，酶活性达到最大值，随后随着数值的增加，酶活性下降，因此，选定第2 组因素水平进行响应面优化。

表5 最陡爬坡实验设计及结果Table 5 Experimental design of steepestascent and corresponding results

2.5 响应面法优化菌株CDA2-2-2 产几丁质脱乙酰酶的发酵条件

2.5.1 响应面设计及结果 根据PB 试验结果确定优选的MgSO4（A）、发酵温度（B）、葡萄糖（C）3 个因素为变量，以酶活大小为响应值，运用Design of Experiments 设计3 因素3 水平共17 个试验点的Box-Behnken 响应面分析试验（表6）。

表6 Box-Behnken 试验设计及结果Table 6 Box-Behnken test design and results

2.5.2 试验数据分析 对试验数据进行回归分析，得二次多项式方程：

由表7 可知：从F值的大小可以得到，一次项中各因素对几丁质脱乙酰酶酶活的影响顺序是B＞C＞A。对几丁质脱乙酰酶酶活的方差分析可得模型P＜0.01，表明该方程模型极显著，不同处理间的差异性极显著；失拟项P＞0.05，表明模型失拟项不显著；模型的R2为0.965，说明该模型能解释96.5%响应值的变化，因而该模型拟合程度良好，试验误差小，可以用于预测最优发酵条件参数[25]。

表7 几丁质脱乙酰酶酶活的回归方差分析表Table 7 Regression analysis of variance of chitinic deacetylase activity

响应面三维图11 表明，响应面开口朝下，响应值随各自变量的值先增加后减少，说明此模型有突出稳定点，且稳定点是该模型的最大值。葡萄糖0.5%，当MgSO4在0.015%～0.022%，发酵温度在35.5～37.5 ℃时酶活最大；发酵温度35 ℃时，当MgSO4在0.015%～0.023%，葡萄糖0.53%～0.59%，酶活力最大；MgSO40.1%时，发酵温度在35.5～38 ℃，葡萄糖0.53%～0.59%，酶活最大。

图11 MgSO4、发酵温度、葡萄糖的交互作用对几丁质脱乙酰酶酶活的影响图Fig.11 Effects of MgSO4,fermentation temperature and glucose interaction on enzyme activity

2.5.3 验证性实验 使用响应面法对发酵工艺条件进行优化[24]，得到最佳培养基组合为：MgSO40.01%、发酵温度37.76 ℃、葡萄糖0.57%，发酵产酶活预测值为14.2932 U/mL。为了保证试验的方便可行，对各个条件做少许修正进行验证实验，MgSO40.01%，发酵温度38 ℃，葡萄糖0.57%进行验证试验，结果显示几丁质脱乙酰酶酶活为14.582 U/mL，与理论值相对误差＜5%，较优化前提高了2.5 倍，优化后菌株CDA2-2-2 发酵产几丁质脱乙酰酶水平为14.582 U/mL，高于部分报道的细菌发酵几丁质脱乙酰酶的发酵水平[5，25]，说明响应面分析得到的模型准确可靠且具有实用性。

3 结论

采用优化发酵条件提高海洋Arthrobacter protophormiaeCDA2-2-2 发酵产几丁质脱乙酰酶水平，在考察了单因素对相对酶活影响的基础上，运用PB 实验设计筛选出显著性影响因素，确定显著性影响因素为MgSO4、发酵温度、葡萄糖。使用响应面法对发酵工艺条件进一步优化获得最佳培养基组合为：MgSO40.01%、发酵温度38 ℃、葡萄糖0.57%。在此条件下，几丁质脱乙酰酶水平较优化前提高了2.5 倍，达到14.58 U/mL。本研究仅通过发酵条件优化提高产酶水平，进一步研究可通过诱变育种进一步提高发酵水平，以及对酶基因进行克隆和高效表达和定性进化研究，提高发酵产酶水平，提高酶的比活力和催化晶体几丁质的活性。