补肾活血壮骨汤对膝骨性关节炎模型大鼠的影响*

马超，唐华羽

佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯154000

膝骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）属于骨科常见的一种疾病，主要表现为膝关节软骨出现退变、软骨基质出现降解，可激发滑膜炎及骨质增生，继而引起关节疼痛、肿胀及功能异常，对患者的生活质量产生一定影响［1－3］。目前，临床治疗KOA的方法包括物理疗法、药物干预、针灸及运动康复等，然而上述治疗方式效果并不理想。近年来随着中医药在KOA治疗中的应用日益广泛，证实了补肾活血壮骨汤治疗骨关节炎可发挥一定的效果［4］。另有研究显示，关节内局限性炎症反应是导致骨性关节炎疼痛的重要原因，其中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）及多种炎症因子均在KOA的发生、发展过程中发挥至关重要的作用［5－7］。骨关节炎的发生也与血液流变指标异常、血液黏度增加及红细胞变形性等密切相关。本文通过研究补肾活血壮骨汤对KOA模型大鼠血液流变学、MMP及炎性因子表达的影响，旨在分析补肾活血壮骨汤治疗KOA的药效作用。

1 材料

1.1 动物150只SPF级SD雄性大鼠，体质量230～250 g，购自郑州大学实验动物中心，许可证号：SCXK（豫）2015－0037，伦理批号：2020154。

1.2 药物与试剂补肾活血壮骨汤方药组成为：熟地黄9 g，补骨脂9 g，红花1.5 g，独活3 g，肉苁蓉3 g，杜仲3 g，当归3 g，没药3 g，山萸肉3 g，菟丝子10 g。基质金属蛋白酶－1（matrix metalloproteinase－1，MMP－1）、基质金属蛋白酶－3（matrix metalloproteinase－3，MMP－3）、基质金属蛋白酶－13（matrix metalloproteinase－13，MMP－13）、基质金属蛋白酶抑制剂－1（matrix metalloproteinase inhibitor－1，TIMP－1）、白细胞介素－6（interleukin－6，IL－6）、肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）、白细胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）酶联免疫吸附试剂盒（武汉博士德生物科技有限公司，批号分别为：20180607、20180704、20180605、20180803、20180706、20180703、20180709）。

1.3 仪器TDZ5－WS型医用离心机（湖南平凡科技有限公司）；DW－86L338型超低温冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）；iMark型全自动酶标分析仪（美国Bio－Rad公司）；足底热痛测试仪（上海软隆科技发展有限公司）。

2 方法

2.1 动物分组及模型复制取150只SD大鼠，随机分成正常组、模型组及补肾活血壮骨汤低剂量（0.010 g·kg－1）、中剂量（0.015 g·kg－1）和高剂量（0.020 g·kg－1）组，每组30只。除正常组外，其余大鼠均以关节腔注射木瓜蛋白酶复制KOA模型［8］。对大鼠进行备皮及消毒处理，剃除大鼠右前肢膝关节部位及以下毛发，用75%乙醇消毒皮肤后，于右前肢膝关节腔内注射4%的木瓜蛋白酶溶液0.2 mL，每2 d一次，连续注射2周。14 d后若发现大鼠出现下述症状时说明复制成功：右前侧膝关节红肿热痛，伴有软组织的肿胀或出现积液；右前侧膝关节以及周围出现僵硬以及活动受限；右前侧膝关节病理检查结果发现关节腔内出现大量渗出液；软骨表面不光滑，存在滑膜增生或粘连等关节炎病理改变。造模成功后第2天，除正常组与模型组以生理盐水灌胃，其余大鼠给予相应的药物。

2.2 观察指标

2.2.1 测定大鼠痛阈值用足底热痛测试仪检测所有大鼠双侧后足趾热痛阈值，每只大鼠均重复测量3次，取平均值，每次检测间隔10 min，以大鼠疼痛后的嘶鸣作为达到痛阈的信号并记录压痛阈值。

2.2.2 观察KOA大鼠足肿胀度及肿胀消退时间

检测足肿胀度时，先将容量为50 mL的量筒内添满蒸馏水，于大鼠的右前侧的膝关节缝的有关矢量面作标记，而后将溢出的水即为大鼠的足肿胀度，检测3次，取平均值。同时记录大鼠足肿胀消退时间。

2.2.3 检测血液流变学指标于干预4周后，腹主动脉取血，检测全血高切、血浆黏度。

2.2.4 检测血清MMP及炎症因子水平于干预4周后采集各组大鼠的股动脉血，1 500 rpm·min－1离心10 min，取血清，采用酶联免疫吸附法检测MMP－1、MMP－3、MMMP－13、TIMP－1、IL－6、TNF－α、IL－1β水平。

2.2.5 观察大鼠关节软骨病理变化上述检测完成后，处死大鼠，每组随机取3只大鼠，取关节软骨，行常规石蜡包埋，制成5μm厚度的切片，行HE染色，在显微镜下观察滑膜细胞增生、炎性细胞浸润、组织粘连及软骨累及情况。

2.3 统计学处理应用SPSS 22.0软件分析数据，以（±s）表示计量资料，%表示计数资料，组间比较分别采用t及χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对大鼠压痛阈值、足肿胀度、肿胀消退时间的影响与正常组比较，模型组压痛阈值明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，补肾活血壮骨汤低、中、高剂量组大鼠压痛阈值升高（P＜0.05），足肿胀度明显减轻（P＜0.05），肿胀消退时间明显缩短（P＜0.05）；与低剂量组比较，补肾活血壮骨汤中、高剂量组大鼠的压痛阈值升高（P＜0.05），足肿胀度明显减轻（P＜0.05），肿胀消退时间明显缩短（P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组大鼠的压痛阈值升高（P＜0.05），足肿胀度明显减轻（P＜0.05），肿胀消退时间明显缩短（P＜0.05）。见表1。

表1 对大鼠压痛阈值、足肿胀度、肿胀消退时间的影响 （±s）

表1 对大鼠压痛阈值、足肿胀度、肿胀消退时间的影响 （±s）

注：与正常组比较，＠P＜0.05；与模型组相比，＃P＜0.05；与补肾活血壮骨汤低剂量组相比，*P＜0.05；与补肾活血壮骨汤中剂量组相比，△P＜0.05

／d正常组组别 n 压痛阈值／kPa 足肿胀度／% 肿胀消退时间30 378.26±21.33－－模型组 30 162.93±21.05＠ 48.39±3.54 10.38±2.39补肾活血壮骨汤低剂量组 30 224.91±29.40＃ 44.01±3.29＃ 7.39±1.94＃补肾活血壮骨汤中剂量组 30 285.01±31.95＃* 39.19±3.20＃* 6.41±1.25＃*补肾活血壮骨汤高剂量组 30 368.74±34.10＃*△ 32.14±2.85＃*△ 5.27±1.04＃*△

3.2 对大鼠全血高切、血浆黏度的影响与正常组比较，模型组大鼠全血高切、血浆黏度水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，补肾活血壮骨汤低、中、高剂量组大鼠全血高切、血浆黏度水平均明显降低（P＜0.05）；与补肾活血壮骨汤低剂量组相比，中、高剂量组大鼠全血高切、血浆黏度水平均明显降低（P＜0.05）；与补肾活血壮骨汤中剂量组比较，高剂量组大鼠全血高切、血浆黏度水平均明显降低（P＜0.05）。见表2。

3.3 对大鼠血清各项MMPs水平的影响与正常组比较，模型组MMP－1、MMP－3、MMP－13水平明显升高，TIMP－1水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，补肾活血壮骨汤低、中、高剂量组MMP－1、MMP－3、MMP－13水平均明显降低，TIMP－1水平明显升高（P＜0.05）；与低剂量组比较，补肾活血壮骨汤中、高剂量组MMP－1、MMP－3、MMP－13水平明显降低，TIMP－1水平升高（P＜0.05）；与中剂量组比较，补肾活血壮骨汤高剂量组MMP－1、MMP－3、MMP－13水平均降低，TIMP－1水平升高（P＜0.05）。见表3。

表2 对大鼠全血高切、血浆黏度的影响（±s）

表2 对大鼠全血高切、血浆黏度的影响（±s）

注：与正常组相比，＠P＜0.05；与模型组相比，＃P＜0.05；与补肾活血壮骨汤低剂量组相比，*P＜0.05；与补肾活血壮骨汤中剂量组相比，△P＜0.05

组别 n 全血高切／mPa·s－1血浆黏度／mPa·s－1 30 4.17±0.45 0.79±0.11模型组 30 5.75±0.65＠ 1.35±0.23＠补肾活血壮骨汤低剂量组30 5.36±0.59＃ 1.14±0.19＃补肾活血壮骨汤中剂量组30 4.68±0.54＃* 0.95±0.14＃*补肾活血壮骨汤高剂量组30 4.20±0.48＃*△ 0.84±0.12＃正常组*△

3.4 对大鼠血清炎症因子水平的影响与正常组比较，模型组大鼠的IL－6、TNF－α、IL－1β水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，补肾活血壮骨汤低、中、高剂量组IL－6、TNF－α、IL－1β水平明显降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，补肾活血壮骨汤中、高剂量组IL－6、TNF－α、IL－1β水平明显降低（P＜0.05）；与中剂量组比较，补肾活血壮骨汤高剂量组IL－6、TNF－α、IL－1β水平均明显降低（P＜0.05）。见表4。

表3 对大鼠血清各项MMPs水平的影响 （±s，μg·L－1）

表3 对大鼠血清各项MMPs水平的影响 （±s，μg·L－1）

注：与正常组比较，＠P＜0.05；与模型组相比，＃P＜0.05；与补肾活血壮骨汤低剂量组相比，*P＜0.05；与补肾活血壮骨汤中剂量组相比，△P＜0.05

MMP－1 MMP－3 MMP－13 TIMP－1正常组 30 68.37±15.92 2.91±0.33 33.44±8.38 7.28±0.组别 n 57模型组 30 102.11±18.74＠ 4.20±0.61＠ 56.20±10.28＠ 5.70±0.34＠补肾活血壮骨汤低剂量组 30 95.23±15.23＃ 3.81±0.52＃ 44.29±9.48＃ 6.23±0.49＃补肾活血壮骨汤中剂量组 30 87.37±12.39＃* 3.41±0.44＃* 40.01±6.10＃* 6.84±0.72＃*补肾活血壮骨汤高剂量组 30 71.04±12.04＃*△ 3.21±0.34＃*△ 35.10±7.13＃*△ 7.20±0.91＃*△

表4 对大鼠血清炎症因子水平的影响 （±s，ng·L－1）

表4 对大鼠血清炎症因子水平的影响 （±s，ng·L－1）

注：与正常组比较，＠P＜0.05；与模型组相比，＃P＜0.05；与补肾活血壮骨汤低剂量组相比，*P＜0.05；与补肾活血壮骨汤中剂量组相比，△P＜0.05

组别 n IL－6 TNF－α IL－1β 30 21.72±1.83 23.37±5.78 5.88±1.20模型组 30 40.91±6.12＠ 39.59±10.29＠ 11.42±2.39＠补肾活血壮骨汤低剂量组 30 36.23±4.20＃ 31.47±9.72＃ 9.15±1.57＃补肾活血壮骨汤中剂量组 30 30.01±3.71＃* 27.03±6.02＃* 7.01±1.42＃*补肾活血壮骨汤高剂量组 30 22.87±2.85＃*△ 24.01±5.81＃*△ 6.14±1.20＃正常组*△

3.5 观察大鼠关节软骨病理变化正常组的大鼠关节软骨表面光滑，无退行性病变，无滑膜组织增生；模型组大鼠的关节腔内炎性细胞明显增多，滑膜细胞增多，伴体积增大，滑膜增厚，滑膜下可见明显组织水肿，基质淡染；补肾活血壮骨汤低剂量组大鼠的关节腔内炎性物质略有减少，软骨表面较模型组稍平整光滑，滑膜组织增生略微减轻；补肾活血壮骨汤中剂量组大鼠的关节腔内炎性物质减少，软骨表面平整光滑，滑膜组织增生减轻；补肾活血壮骨汤高剂量组大鼠的关节腔内炎性物质明显减少，软骨表面平整光滑，滑膜组织增生显著减轻。见图1。

图1 各组大鼠的关节腔病理图（HE，×200）

4 讨论

中医认为KOA属于“痹症”范畴，该病和年老体衰、外感风寒湿邪及长期劳损等密切相关，其病机主要为本虚标实，且以肾虚为本、血瘀为标，肾虚血瘀贯穿于骨性关节炎发病过程［9－11］。中医药治疗KOA有明显的优势，受到广泛的关注［12－14］。有研究显示，中医药可通过改善局部微循环，抑制氧自由基的产生，促进软骨局部胶原及蛋白多糖的合成等途径减轻骨关节炎病理变化，从而延缓疾病的进展［15－17］。补肾活血壮骨汤的组成为熟地黄、补骨脂、红花、独活、肉苁蓉、杜仲、当归、没药、山萸肉及菟丝子。其中熟地黄补血养阴，填精益髓；杜仲补益肝肾、强筋健骨；菟丝子补益肝肾；当归活血化瘀；没药散瘀止痛，消肿生肌；山萸肉补益肝肾；红花活血通络；独活祛风除湿；肉苁蓉补益肝肾；补骨脂补肾壮阳、健脾和胃；诸药合用，共奏补肾活血、益气壮骨之功［18］。

本研究发现，经补肾活血壮骨汤治疗后，大鼠的全血高切、血浆黏度水平均明显降低，还可提高大鼠压痛阈值，减轻足肿胀度，缩短肿胀消退时间，上述变化随药物剂量的增加逐渐明显，可能是方中红花具有活血通络的功效，杜仲发挥强筋健骨的功效，菟丝子和山萸肉具有补肝益肾的作用，补骨脂与熟地黄相配伍，发挥补血益肾的功效，独活具有通络镇痛的作用，没药可改善软骨细胞功能，诸药共用可增加关节液分泌，促进组织局部血液、淋巴循环，加快局部代谢，并缓解肌肉、韧带、关节囊的挛缩［19－21］。此外，MMP－1及MMP－13属于胶原酶，可对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原起到降解作用，MMP－3则被称为间质溶解素，主要对Ⅳ型胶原、明胶、糖蛋白及蛋白聚糖等物质进行水解，而TIMP－1通过与MMPs形成复合物，继而抑制部分的MMPs的低分子生理性抑制剂。正常生理状态下，MMP及TIMP存在动态平衡，在维持软骨细胞生理功能方面起着至关重要的作用［22－24］，当两者的平衡被打破，会促进软骨退变的发生，进一步导致KOA［25－27］。本研究发现，补肾活血壮骨汤可改善大鼠血清MMP－1、MMP－3、MMP－13及TIMP－1水平，且随药物剂量的不断增加，上述指标改善程度越明显，说明补肾活血壮骨汤在改善大鼠MMP方面效果明显，提示补肾活血壮骨汤治疗KOA的可能机制与维持MMP、TIMP平衡有关。另外，补肾活血壮骨汤可降低大鼠的血清IL－6、TNF－α、IL－1β水平，且与药物剂量明显相关，这与张峰［28］的研究结果相似。IL－6具有促进TIMP合成、分泌的作用，继而促进软骨细胞的增殖；而IL－1β可促进MMP基因的表达，并刺激软骨细胞及滑膜细胞产生一氧化氮，进一步引发炎症反应；TNF－α则可刺激滑膜细胞分泌前列腺素E2，从而刺激MMP的产生，促进软骨的吸收，提示补肾活血壮骨汤的治疗机制可能和抑制炎症因子水平有关［29－30］。病理结果显示，随着补肾活血壮骨汤剂量的增加，大鼠关节滑膜细胞、炎性浸润及组织粘连改善程度提高，充分证实了该药应用于KOA模型大鼠的有效性。

综上所述，补肾活血壮骨汤治疗KOA模型大鼠的效果明显，可显著改善血液流变学，治疗效果和补肾活血壮骨汤的剂量有关，即高剂量改善效果更明显，其疗效机制可能与调节基质金属蛋白酶及炎性因子有关。