木犀草素抑制ERK1／2与p38 MAPK的活化介导鼻咽癌CNE1细胞的生长、移动性和肿瘤干细胞样特性*

陈进芬，刘平，陈静，吴志勇，华清泉，王兰

1.应城市人民医院，湖北 应城432400；2.武汉大学人民医院，湖北 武汉430000；3.武汉科技大学附属医院，湖北 武汉430000

鼻咽癌是一种位于鼻咽部的上皮恶性肿瘤，在世界范围内仍保持较高的发病率［1］。鼻咽癌具有局部侵袭和早期远处转移的特点，遗传易感性、Epstein－Barr病毒（EBV）感染和环境因素是鼻咽癌的三大主要诱因［2］。目前，对于局部晚期的鼻咽癌，化学疗法、放射疗法无疑是标准的治疗方法，可将病死率降低18%，并将5年总生存率提高4～6%［3］。虽然鼻咽癌对放疗和化疗很敏感，但由于其具有很高的转移潜能，30～40%的鼻咽癌患者会在4年内发生远处转移，因此这些治疗方法的有效性受到严重影响，这也是鼻咽癌治疗失败的主要原因［4］。减少复发和预防转移是鼻咽癌成功治疗的关键。目前鼻咽癌的病理分子机制尚不清楚，了解鼻咽癌的病理机制，寻找新的治疗药物是非常必要的。木犀草素是黄酮类化合物家族中的一员，通常以糖基化形式存在于草本植物木犀草中。木犀草素可直接诱导大量人类癌细胞凋亡［5－7］，并提高癌细胞对化疗或生物治疗药物的敏感性［8］。大量研究表明，木犀草素具有抗肿瘤的潜力，但其对鼻咽癌的作用及确切潜在机制仍不清楚。本研究探索木犀草素对鼻咽癌CNE1细胞生长、运动和肿瘤干细胞样特性的影响以及是否存在ERK1／2和p38 MAPK信号通路的参与，检测该通路相关蛋白的表达情况，从而确定新的治疗靶点，以期为木犀草素应用于鼻咽癌的防治提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞CNE1细胞株（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，GDC0208），培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，放置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2 试剂与药物DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、B27、bFGF、EGF（美国Gibco公司，批号：11039021、12483020、15400054、12587010、13256－029、PHG0311）；RIPA裂解液（P0013HD，碧云天，上海）；二喹啉甲酸BCA蛋白浓度测定试剂盒（PA115，天根生物公司，北京）；5－ethynyl－2′－deoxyuridine（EdU）检测试剂盒（C00053，锐博生物，广州）；MatrigelTM底膜基质（3356234，BD公司，美国）；Super RT cDNA试剂盒（CW0741M，康为世纪，北京）；Quantifast®SYBR®Green PCR Kit（204054，QIAGEN，德国）；Ki67、Bcl－2、Bax、Survivin、c－Myc、vascular endothelial growth factor（VEGF）、Vimentin、Fibronectin、ERK1／2抗体、p38 MAPK抗体（批号：ab92742、ab32124、ab182734、ab76424、ab32072、ab72807、ab16700、ab32419、ab17942、ab4822，Abcam公司，美国）；HRP标记的山羊抗小鼠以及羊抗兔二抗（批号：sc－2005、sc－2040，Santa Cruz公司，美国）；细胞凋亡检测试剂盒（批号：KGA1016，南京凯基生物有限公司，中国）；木犀草素（批号：L9283，纯度：98%，Sigma公司，美国）。

1.3 仪器高速低温离心机（Beckman公司，美国）；CO2培养箱、ABI 7500实时荧光定量PCR仪（Thermo公司，美国）；电泳槽、电转仪（Bio－Rad公司，美国）；27145型低黏附6孔板（诺为生物，北京）；流式细胞仪（Beckman公司，美国）；电热恒温水浴箱（Grant公司，英国）；GDS－800凝胶成像系统（UVP公司，美国）；ChemiDoc XRS凝胶／发光图像分析仪（Bio－Rad公司，美国）。

2 方法

2.1 细胞培养CNE1细胞株在含10%胎牛血清的培养基中生长，当细胞汇合率达到80%以上时用0.25%胰酶进行消化传代，取3～8代细胞用于实验。药物干预前，将细胞调整至适当密度，接种于96孔、24孔或6孔培养板中，待细胞生长至融合状态，用1%低血清培养基培养12 h使细胞同歩化。

2.2 分组与给药将CNE1细胞分4组处理：对照组：在细胞融合后，用含正常血清的DMEM培养基培养48 h后，换为无血清DMEM培养基培养；药物处理组：在细胞融合后，用含低、中、高剂量（5、10、20 mg·L－1）木犀草素及正常血清的DMEM培养基培养48 h后，换为不加药物的无血清DMEM培养基培养。

2.3 Ed U染色检测细胞增殖状态严格按照试剂盒说明书操作，具体如下：将处理过的各组细胞用50μmol·L－1的EdU培养12 h，用4%的多聚甲醛固定细胞30 min，然后用5%的甘氨酸孵育5 min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。0.5%Triton X－100破膜后，用抗－EdU抗体孵育30 min，再用5 mg·L－1Hoechst 33342染色30 min，荧光显微镜观察并照相。

2.4 免疫印迹法检测相关蛋白的表达使用裂解缓冲液裂解细胞样品，并用BCA蛋白质测定试剂盒定量蛋白质浓度。含有20μg蛋白质的10μL样品在10%SDS－PAGE中分离，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，随后加入一抗（Ki67、Bcl－2／Bax、Survivin、c－Myc、VEGF、Vimentin、Fibronectin、ERK1／2、p－ERK1／2、p38 MAPK、p－p38 MAPK，1∶1 000）于4℃封闭过夜，第2天加入对应二抗室温封闭1 h，最后滴加ECL，设置曝光参数，检测目的条带化学发光强弱。

2.5 Transwell检测CNE1细胞的侵袭能力将木犀草素处理过的细胞消化离心，无血清培养基重悬细胞，以每孔1×104个细胞数量种入上室，下室加入有血清的培养基。48 h后用无菌棉签擦去小室上层细胞，将transwell小室倒置风干，并放入含有500μL染色液（0.1%结晶紫）的12孔板中，染色20 min，PBS清洗3次，风干。在transwell小室直径上，取5个视野，在显微镜下拍照计数。

2.6 成球实验检测肿瘤干细胞样特性收集对数生长期的CNE1细胞，用DMEM培养基洗1次并重悬，血细胞计数器统计细胞密度。在低黏附6孔板中加2%B27、20μg·L－1bFGF和20μg·L－1EGF的DMEM培养基，每孔接种1 000个细胞，置于5%CO2恒温培养箱中。每隔2 d补加新鲜培养基，分别加药处理14 d，于倒置显微镜下拍照并统计成球直径和成球率。

2.7 RT－PCR检测相关基因的mRNA表达使用TRIzol试剂提取总RNA，并通过超微紫外光分光光度计在260和280 nm处测定吸光度。按照试剂盒说明书，使用Super RT cDNA试剂盒合成cDNA。使用Quantifast®SYBR®GreenPCR Kit进行PCR，分别在95℃15 s和60℃60 s条件下使用ABI 7500将反应激活。用于该反应的CD33、SOX－2、OCT4及β－actin的引物信息见表1。

2.8 统计学方法使用SPSS 21.0（SPSS，Inc，Chicago，IL，USA）分析所有数据。所有实验至少独立重复3次，每个独立重复检测3次。测量数据表示为平均值±标准偏差。使用LSD方法进行成对比较，采用t检验比较两组间符合正态分布的数据。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 木犀草素抑制鼻咽癌CNE1细胞的增殖与对照组比较，中、高剂量木犀草素处理后，EdU红色标记的细胞明显减少，即增殖细胞占比减少。结果见图1。

表1 RT－PCR的引物序列

图1 鼻咽癌CNE1细胞的增殖变化（EdU染色，×400）

3.2 木犀草素抑制Ki67、Bcl－2／Bax、Survivin、c－Myc的蛋白表达与对照组比较，低剂量组Ki67和Bcl－2／Bax蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），中、高剂量组Ki67、Bcl－2／Bax、Survivin、c－Myc蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），提示木犀草素可抑制鼻咽癌CNE1细胞中Ki67、Bcl－2／Bax、Survivin、c－Myc蛋白的表达。结果见图2，表2。

3.3 木犀草素抑制鼻咽癌CNE1细胞的侵袭能力

与对照组比较，中、高剂量的木犀草素处理后侵入到小室膜底侧的CNE1细胞数量明显减少，即侵袭性细胞数减少。结果见图3。

表2 不同浓度木犀草素处理后Ki67、Bcl－2／Bax、Survivin、c－Myc的蛋白表达 （±s）

表2 不同浓度木犀草素处理后Ki67、Bcl－2／Bax、Survivin、c－Myc的蛋白表达 （±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

Myc／GAPDH／%对照组组别 Ki67／GAPDH／% Bcl－2／Bax Survivin／GAPDH／% c－23.26±3.05 6.93±0.92 14.21±2.54 18.06±3.25低剂量木犀草素组 19.41±5.46* 3.81±0.28* 14.02±1.93 16.32±3.84中剂量木犀草素组 6.26±1.03* 0.18±0.04* 5.19±1.22* 6.87±1.47*高剂量木犀草素组 3.85±1.64* 0.04±0.01* 1.28±0.58* 1.02±0.94*

图3 不同浓度木犀草素处理后CNE1细胞侵袭能力的变化

3.4 木犀草素抑制VEGF、Vimentin、Fibronectin的蛋白表达与对照组比较，中、高剂量组VEGF、Vimentin、Fibronectin蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。结果见图4，表3。

3.5 木犀草素降低鼻咽癌干细胞特性与对照组比较，低、中、高剂量组肿瘤干细胞成球直径和数目均显著减少（P＜0.05）。结果见图5，表4。

表3 不同浓度木犀草素处理后VEGF、Vimentin、Fibronectin的蛋白表达 （±s）

表3 不同浓度木犀草素处理后VEGF、Vimentin、Fibronectin的蛋白表达 （±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别 VEGF／GAPDH／%Vimentin／GAPDH／%Fibronectin／GAPDH／%对照组66.29±9.64 42.41±8.05 93.45±10.24低剂量木犀草素组 63.11±8.05 41.45±7.26 89.14±12.53中剂量木犀草素组 19.25±5.42*13.43±4.92*22.77±6.42*高剂量木犀草素组 7.17±3.19*10.15±3.67*16.84±5.17*

图4 不同浓度木犀草素处理后VEGF、Vimentin、Fibronectin的蛋白表达

3.6 木犀草素抑制CD33、SOX－2、OCT4 mRNA的表达与对照组比较，低剂量组OCT4 mRNA表达量显著降低（P＜0.05）；中、高剂量组CD33 mRNA、SOX－2 mRNA、OCT4 mRNA表达量均显著降低（P＜0.05）。结果见表5。

表4 不同浓度木犀草素处理后肿瘤干细胞成球体积和数目的变化 （±s）

表4 不同浓度木犀草素处理后肿瘤干细胞成球体积和数目的变化 （±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别 成球直径（l／μm）成球数目／100个细胞对照组128.64±19.06 87.29±16.41低剂量木犀草素组 95.31±12.85* 73.16±14.27*中剂量木犀草素组 28.14±6.93* 28.07±9.03*高剂量木犀草素组 10.27±4.62* 23.91±8.81*

表5 不同浓度木犀草素处理后CD33、SOX－2、OCT4的mRNA表达 （±s）

表5 不同浓度木犀草素处理后CD33、SOX－2、OCT4的mRNA表达 （±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别 CD33 mRNA（2－ΔΔCt）SOX－2 mRNA（2－ΔΔCt）OCT4 mRNA（2－ΔΔCt ）对照组1 1 1低剂量木犀草素组0.93±0.07 0.94±0.06 0.82±0.08*中剂量木犀草素组0.61±0.03*0.58±0.03*0.44±0.06*高剂量木犀草素组0.25±0.04*0.23±0.05*0.13±0.02*

图5 不同浓度木犀草素处理后肿瘤干细胞成球体积和数目的变化

3.7 木犀草素抑制ERK1／2和p38 MAPK的磷酸化水平与对照组比较，低剂量组p－ERK1／2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；中、高剂量组p－ERK1／2和p－p38 MAPK蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。结果见图6，表6。

图6 不同浓度木犀草素处理后ERK1／2和p38 MAPK磷酸化水平的变化

表6 不同浓度木犀草素处理后ERK1／2和p38 MAPK磷酸化水平的变化 （±s）

表6 不同浓度木犀草素处理后ERK1／2和p38 MAPK磷酸化水平的变化 （±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

p－ERK1／2／ERK1／2 p－p38 MAPK／p38 MAPK对照组组别0.88±0.05 0.36±0.05低剂量木犀草素组 0.69±0.06* 0.35±0.04中剂量木犀草素组 0.14±0.02* 0.07±0.03*高剂量木犀草素组 0.08±0.03* 0.02±0.01*

4 讨论

鼻咽癌是起源于鼻咽部黏膜上皮的肿瘤，常发生在鼻咽部咽隐窝和顶前壁部位，是我国南部和东南亚地区最常见的头颈部恶性肿瘤之一。鼻咽癌浸润生长快，恶性程度高，且其解剖部位特殊，早期病灶小，症状不典型，临床上易忽略及误诊，发病早期就可能发生颈部淋巴结转移，甚至远处转移［9］。放疗是主要的治疗手段，但目前放射疗法和化学疗法不能完全根除肿瘤［10］。鼻咽癌放疗后局部复发和远处转移是制约其疗效，影响其预后的主要原因［11］。因此，研究鼻咽癌的分子机理，寻找新的鼻咽癌治疗方法已成为鼻咽癌防治的关键所在。

抑制细胞生长和诱导细胞死亡是抑制肿瘤生长的两种主要手段［12］。细胞凋亡对于维持组织稳态和预防癌症发展至关重要［13］。研究发现，木犀草素可通过下调Bcl－2和Survivin蛋白的表达，上调Bax蛋白的表达，以剂量依赖性的方式有效抑制骨肉瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡［14］。木犀草素抑制过表达cMet的PDTX模型肿瘤生长，诱导细胞凋亡，并显著下调MMP9、Ki－67和cMet的表达［15］。Wang等［16］研究发现，木犀草素可以抑制Eca109的增殖，下调c－Myc的mRNA水平，降低c－Myc在Eca109细胞中的蛋白表达。与前人研究结果一致，本研究发现，木犀草素可抑制CNE1的增殖，下调Ki67、Bcl－2／Bax、Survivin、c－Myc蛋白表达水平，表明木犀草素能促进鼻咽癌CNE1细胞的凋亡，抑制其生长。

癌症具有高侵袭转移潜能，这是导致治疗失败的主要原因［17］。研究发现，木犀草素对CAOV3／DDP细胞的侵袭具有剂量依赖性的抑制作用［18］。Zang等［19］通过Transwell实验发现，木犀草素处理可显著抑制胃癌细胞的侵袭，间质生物标志物Vimentin的蛋白水平呈剂量依赖性降低。研究证实在木犀草素处理后，Vimentin和VEGF的蛋白水平均明显降低，抑制结直肠癌细胞的上皮间质转化［20］。同样，木犀草素能够抑制U87细胞的侵袭，抑制人胶瘤细胞对Fibronectin的黏附［21］。与之前的研究结果相似，本研究发现，木犀草素抑制鼻咽癌CNE1细胞的侵袭，显著下调VEGF、Vimentin、Fibronectin蛋白表达水平，表明木犀草素具有抑制鼻咽癌CNE1细胞侵袭和运动的作用。

鼻咽癌肿瘤干细胞能产生异质肿瘤细胞，具有很强的自我更新能力，促进肿瘤的发生发展，与鼻咽癌的耐药、复发和转移密切相关。Wang等［22］使用Hoechst 33342从NPC细胞系CNE－2中分选出的侧群细胞具有干细胞特性，对体内和体外的化学疗法和放射疗法具有抗性。研究发现，给予mTOR信号抑制剂后，mTOR信号激活被抑制，CD133、SOX2、OCT4表达减少，雷帕霉素处理后，鼻咽癌肿瘤干细胞样活性被抑制［23］。本研究发现，木犀草素能够明显抑制在成球实验中CNE1的成球能力，降低其中肿瘤干细胞的比例，下调CD33 mRNA、SOX－2 mRNA、OCT4 mRNA的表达量，表明木犀草素能降低鼻咽癌肿瘤干细胞活性。

ERK1／2和p38 MAPK信号通路在肿瘤的发生和发展过程中发挥着重要作用。Shen等［24］研究发现，p38 MAPK和ERK1／2磷酸化水平的降低参与了木犀草素介导的UPEC入侵抑制，木犀草素预处理细胞可明显抑制p38 MAPK和ERK1／2的激活。木犀草素在EGF诱导的MCF－7乳腺癌细胞中具有抑制MAPK和p－ERK1／2信号通路活性的潜力［15］。本研究发现，木犀草素明显降低ERK1／2和p38 MAPK的磷酸化水平，推测木犀草素可通过抑制ERK1／2和p38 MAPK的活性抑制鼻咽癌的发生发展。

综上所述，木犀草素可抑制鼻咽癌CNE1细胞的生长和运动，降低鼻咽癌干细胞样特性，其机制可能与抑制ERK1／2和p38 MAPK的磷酸化有关。