舒肝益脾颗粒质量标准研究*

颜瑞琪，栗建明，顾利红，侯惠婵，袁震霆

（广州市药品检验所·国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，广东 广州 510160）

舒肝益脾颗粒由茵陈、蒲公英、五味子、黄芪、茯苓、山楂组方，具有清化湿热、舒肝利胆、解毒退黄、健脾和胃功效［1］，为肝胆类疾病临床常用药。茵陈为方中君药；五味子中含有木脂素类（五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素等）、挥发油类和三萜类等活性成分，具有保肝护肝、镇静催眠、抗氧化、增强免疫力等药理作用［2－7］。目前，该品种有 6 家企业拥有批准文号，各企业执行的质量标准均不一致，生产工艺参数、检验项目、含量测定指标和限度均有较大差异，包括含蔗糖型和无蔗糖型。由于已有标准中薄层色谱（TLC）鉴别缺乏对茵陈的质量控制，五味子含量测定仅以单一成分为控制指标，质量标准不完善，不能有效控制该品种的质量。近年来，多指标含量测定已广泛应用于中药材、中成药的质量控制［4，8－17］。本课题中采用 TLC 法对茵陈进行定性鉴别，并采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定舒肝益脾颗粒中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量，建立完善的质量标准，为该制剂的深层次开发和质量控制提供可行性方案。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC－20A 型高效液相色谱仪，包括SIL－20AC 自动进样器、CTO－20A 柱温箱、SPD－M20A 检测器和LabSolutions 色谱工作站（日本 Shimadzu 公司）；XP26 型和XS204 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；硅胶G60 薄层预制板（德国 Merck 公司）；Elmasonicp P300H型超声仪（德国Elma 公司）。

1.2 试药

茵陈对照药材（批号为120950－201608），五味子醇甲对照品（批号为110857－201815，含量为99.7%），五味子甲素对照品（批号为110764－201714，含量为99.3%），五味子乙素对照品（批号为110765－201512，含量为99.0%），均购自中国食品药品检定研究院；舒肝益脾颗粒（M1 公司，批号为 S1 及 S2；M2 公司，批号为 S3－S7；M3 公司，批号为 S8－S12）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 茵陈 TLC 鉴别

取样品10 g（含蔗糖型）或2 g（无蔗糖型），研细，加甲醇30 mL，超声（功率为380 W，频率为37 kHz，下同）处理30 min，滤过，滤液浓缩至5 mL，即得供试品溶液。另取茵陈对照药材 1.5 g，加水 30 mL，煎煮 60 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL 使溶解，即得对照药材溶液。另取缺茵陈的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2015 年版《中国药典（四部）》（通则 0502）TLC 法试验，在温度为 20 ℃、相对湿度为58%条件下吸取上述供试品溶液2 ～4 μL 及对照药材溶液、阴性对照品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯 － 乙酸乙酯 － 丙酮（5 ∶3 ∶2，V ／ V ／ V）为展开剂，展开，取出，晾干，置365 nm 紫外光灯下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同蓝色的荧光主斑点。阴性对照无干扰。详见图1。

2.2 五味子含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）－ 0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱 （0 ～ 15 min 时 56%A，15 ～ 25 min 时 56% →75%A，25 ～44 min 时 75%A）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：217 nm；柱温：30 ℃。

图1 薄层色谱图1.Negative reference solution 2.Reference medicinal materials solution 3 － 14.Test solution（batch number：S1 － S12）Fig.1 TLC chromatograms

2.2.2 溶液制备

取3 种对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲50 μg、五味子甲素10 μg、五味子乙素15 μg 的混合对照品溶液。取装量差异项下供试品，研细，取约 5.0 g（含蔗糖型）或 1.0 g（无蔗糖型），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，取出，放冷，再称定质量，加甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过；精密量取续滤液25 mL，蒸至近干，残渣加甲醇使溶解，并移至5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得供试品溶液。取缺五味子的阴性样品（企业提供），按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

系统适用性试验：精密吸取2.2.2 项下3 种溶液各适量，按2.2.1 项下色谱条件进样测定。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置有吸收峰，阴性对照无干扰。理论板数按五味子醇甲峰计应不低于3 000，分离度大于1.5，基线分离良好。详见图2。

线性关系考察：取3 种对照品适量，精密称定，加甲醇，制成五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素质量浓度分别为 0.250 6，0.125 2，0.168 9 mg ／mL 的混合对照品贮备液，稀释成不同质量浓度的系列混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，依法测定。以各成分峰面积为纵坐标（Y）、进样量为横坐标（X，ng）进行线性回归，回归方程及线性范围见表1。

精密度试验：取已知质量浓度（五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素质量浓度分别为 49.790，9.985，14.964 μg ／mL）的对照品溶液，按 2.2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的 RSD 分别为0.03%，0.09%，0.08%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

图2 高效液相色谱图1. schisandrol 2.schisandrin A 3. schisandrin BA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

表1 线性关系考察结果（n ＝10）Tab.1 Results of linear relation test（n ＝ 10）

稳定性试验：取样品1.0 g（无蔗糖型，批号为S7）或5.0 g（含蔗糖型，批号为S12），依法制备供试品溶液，分别在室温下放置 0，4，8，16，24，30，36 h 时按 2.2.1 项下色谱条件进样测定。结果五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素峰面积的 RSD 均小于 1.00% （n ＝ 7），表明供试品溶液在室温下36 h 内稳定。

重复性试验：取样品1.0 g（无蔗糖型，批号为S7）或5.0 g（含蔗糖型，批号为S12），依法平行制备供试品溶液各6 份，再按2.2.1 项下色谱条件进样测定。结果无蔗糖型样品中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量分别为 0.564 3，0.090 7，0.141 4 mg ／g，RSD 分别为 1.40% ，1.40% ，1.50% （n ＝6）；含蔗糖型样品中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量分别为0.127 9，0.061 6，0.087 8 mg ／g，RSD 分别为 0.67% ，1.51%，1.48%（n ＝6）。表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品约0.5 g（无蔗糖型）和 2.5 g（含蔗糖型），各 6 份，精密称定，分别精密加入混合对照品溶液50 mL，依法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n ＝6）Tab.2 Results of the recovery test（n ＝ 6）

2.2.4 样品含量测定

取12 批样品，每批取1 袋，依法制备供试品溶液，进样测定，以外标法计算含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg／袋，n ＝2）Tab.3 Content determination of schisandrol，schisandrin A and schisandrin B in the samples（mg ／bag， n ＝ 2）

3 讨论

茵陈为舒肝益脾颗粒方中君药，但目前各企业现行标准中均无该药材的鉴别项目，2015 年版《中国药典（一部）》中所载茵陈分为绵茵陈和花茵陈。前期调研结果显示，生产企业均使用绵茵陈投料。参考生产工艺，对照药材采取水煮后醇提的处理方法，尽量保持与生产过程一致。同时，还考察了不同厂家的薄层色谱板（青岛海洋硅胶G 板、山东烟台硅胶G 板和默克硅胶 G60板），不同温度（5，20，30 ℃ ），不同相对湿度（32%，58%，88%）对结果的影响。结果显示，在色谱板、温度、相对湿度发生一定变化时，本方法能满足试验要求，耐用性良好。

预试验中分别考察了提取方法（超声提取、回流提取），提取溶剂（体积分数为100%、75%、50%的甲醇和三氯甲烷），提取时间（30，45，60 min）对 3 种木脂素类成分提取率的影响。结果显示，以甲醇超声提取30 min 的效率较高，且提取时间适宜，故最终选择此方法制备供试品溶液。

2015 年版《中国药典（一部）》五味子含量测定项下检测波长为250 nm，故本试验中采用二极管阵列检测器，在 190 ～ 400 nm 波长范围进行扫描，结果显示，3 种对照品在217 nm 和250 nm 波长处均有最大吸收，但五味子甲素、五味子乙素在250 nm 波长处响应值较弱，故最终选定217 nm 作为检测波长。

由于现行标准各企业所控制的成分各不相同，所测成品中五味子相应成分含量差异较大。本研究中建立的HPLC 法可用于同时测定舒肝益脾颗粒中3 种木脂素类成分含量，该方法较现行标准增加了五味子的指标成分数量，有利于对五味子原料质量的全面控制，设立统一的监测指标并评价该品种质量的一致性。

综上所述，本研究中所建立的方法操作简便，准确度和精密度高，重复性和稳定性好，可用于舒肝益脾颗粒中茵陈的薄层鉴别，以及五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素3 种木脂素类成分含量的同时测定，可为舒肝益脾颗粒质量标准的建立提供参考。