基于广泛靶向代谢组学的瓠瓜果实鲜味差异代谢物分析

鲁忠富 李艳伟 汪 颖 吴晓花 吴新义 王 尖 汪宝根 李国景

（浙江省农业科学院蔬菜研究所，浙江杭州 310021）

随着人民生活水平的不断提高和蔬菜供求关系的变化，风味已经成为衡量蔬菜产品质量的重要指标。风味（口感）品质主要取决于三方面因素，一是营养成分，如糖、有机酸、氨基酸、维生素等的含量；二是具挥发性的芳香物质，如醇类、醛类、酮类、萜类和酯类以及含硫化合物等的含量及比例；三是蔬菜产品的质地特性，如纤维感、粉质感、汁液率等。不同瓜果蔬菜的风味决定因子差异很大，如西瓜中糖含量的高低显著影响西瓜的品质及口感，番茄风味主要取决于果实中酸味和甜味的比例，还受一些香味物质的影响（Baldwin et al.，2000；Tieman et al.，2012，2017）。

瓠 瓜〔Lagenaria siceraria（Molina）Standl.〕别名瓠子、长瓜、夜开花、葫芦等，属于葫芦科葫芦属一年生草本植物。瓠瓜在我国已有逾7 000年的栽培历史，常年栽培面积超过13.3 万hm2，是我国尤其是南方地区重要的特色瓜类蔬菜作物。鲜味是瓠瓜最重要的品质性状（吴晓花 等，2018）。不同成熟期或不同品种类型瓠瓜内在风味品质差异巨大：瓠瓜幼果期几乎无味，商品成熟果则呈现较强的鲜味；棒型瓠瓜鲜味较淡，葫芦型瓠瓜鲜味则较浓。这些鲜味的差异深刻影响了瓠瓜产品的经济价值。Wu 等（2017）围绕瓠瓜品质开展研究，发现游离谷氨酸含量对瓠瓜鲜味起重要作用，对139 份自然群体进行游离氨基酸含量的靶向测定并进行全基因组关联分析，鉴定到17 个与游离谷氨酸含量相关的SNP位点，解释了60.7%的遗传变异。然而，由于瓠瓜鲜味为复杂性状，除游离谷氨酸外其他影响瓠瓜鲜味的物质成分及其遗传基础尚不清楚。

由于果实鲜味与外形、产量等易于量化的性状不同，它是一种能定性“感觉到”，但难于定量描述的品质性状，且易受品尝人的主观影响，鲜味的鉴定和评价难度较大，一直以口感品尝为主，缺乏精确精准的定量。代谢组学（metabonomics）是对某一生物或细胞在特定生理或发育状态下所有低分子量代谢物同时进行定性和定量分析的一门新学科，是定量评价果蔬品质的有效途径之一。本试验采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）的广靶向代谢组学技术，通过主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分 析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）等多元统计分析方法，鉴定不同瓠瓜品种商品成熟期果实中显著差异代谢物质，找寻影响瓠瓜鲜味的关键因子。

1 材料与方法

1.1 试验材料

瓠瓜品系I77 和Nanxiu 由浙江省农业科学院蔬菜研究所提供，选择商品成熟期果实为供试材料，通过前期已经建立的品尝方法（Wu et al.，2017），对瓠瓜总体口感程度进行评估，每份材料设置3 个重复。具体操作如下：采摘商品成熟期瓠瓜果实，切取果实中间部分，一份用于生食，一份用于蒸煮，由品尝小组对总体口感程度进行评估，品尝小组由15 个经验丰富、味觉和嗅觉正常、年龄在20～60岁之间的成员组成。以鲜味适中的主栽品种杭州长瓜为对照（5 分），0 分代表“几乎无鲜味”，10 分代表“鲜味极浓”，各成员独立打分后取平均数。经口感品尝，I77 鲜味较浓（8 分），Nanxiu 鲜味较淡（3 分）。2 份材料均于2019年9 月种植于浙江省农业科学院蔬菜研究所杨渡基地大棚中。开花授粉后8～10 d 取样，果实鲜样分别经榨汁机榨成匀浆置于50 mL 离心管中，存放在-80 ℃超低温冰箱中。每份材料取3 个果实作为1 个重复，3 次重复。

1.2 样品前处理方法

瓠瓜果实匀浆经真空冷冻干燥处理，利用研磨仪（MM 400，Retsch）研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末状；称取100 mg 样本粉末，置于1.2 mL 提取液中溶解，4 ℃静置6 h，为提高提取率，期间需要在涡旋仪上涡旋数次；离心10 min（9870r∙min-1，4 ℃），用注射器吸取200μL 上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，转移到UPLC-MS/MS进样瓶中。

1.3 色谱和质谱采集条件

数据采集仪器系统主要包括超高效液相色 谱（UPLC，Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A）和串联质谱（MS/MS，Applied Biosystems 6500 QTRAP）。

1.3.1 色谱条件 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 柱（1.8μm，100 mm × 2.1 mm），购自沃特世科技（上海）有限公司，以0.04%乙酸水溶液为流动相A，以0.04%乙酸乙腈为流动相B；洗脱梯度：0 min 时，B 相比例为5%；10 min 内B 相比例线性增加到95%，并维持在95% 1 min；11.0～11.1 min，B 相比例降为5%，并以5%平衡至14 min。流速为0.35mL∙min-1，进样量为2μL，柱温为40 ℃。所用试剂均购自德国默克公司。

1.3.2 质谱条件 样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式，正负离子扫描范围为50～1 250 Da，毛细管电压为5 500 V（正模式）/-4 500 V（负模式），碰撞电压为-70～70 V；电喷雾离子源温度为550 ℃，质谱电压为550 V，帘气为0.20 MPa，碰撞诱导电离参数设置为高。在三重四级杆中，每个离子对是根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测（Chen et al.，2013）。

1.4 代谢物定性与定量

基于ABSciexQTRAPLC-MS/MS 检测平台采集样本代谢物质谱信息，与广泛靶向代谢组数据库MWDB（metware database）匹配，鉴定样本中代谢物。通过ABSciexQTRAPLC-MS/MS 检测平台，利用三重四级杆质谱的多反应监测模式（MRM）获得样本中代谢物峰面积数据，得到代谢物在不同样本中的相对含量。

1.5 数据分析

将原始数据导入代谢组学处理软件Analyst 1.6.3 进行去背景噪音及低质量的处理，包括基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化等，处理后的数据进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），再根据变量对分组贡献值（VIP）的大小、差异倍数值（fold change，FC）、组间变化的显著性（P＜0.05）进行差异性代谢物的筛选。鉴别差异代谢物的主要数据库为迈维自建数据库MWDB（metware database）及代谢物信息公共数据库，最后根据差异代谢物结果进行PCA、聚类热图和代谢通路分析。

2 结果与分析

2.1 不同瓠瓜品系质谱分析模型评估

在三重四级杆质谱的多反应检测模式（MRM）下对I77 和Nanxiu 样本进行分离和数据采集，利用Analyst 1.6.3 软件进行质谱数据处理，获得各个样本的总离子流图（TIC），可见，色谱峰基线平稳，峰分离效果良好，信号稳定（图1-A～1-D）。采用主成分分析建模方法对所鉴定的402 种代谢物进行分析，发现当PC1=45.08%，PC2=19.24%时，不同品系间能够明显分开，同一品系的样本没有明显分离，且3 次生物学重复数据能够较好地集中在一起（图1-E）。OPLS-DA 得分图显示，I77 和Nanxiu 的代谢物明显分离，将全部样品都位于置信区间内，参数R2Y ＞0.99、Q2 ＞0.90，表明各品系之间存在显著差异（图1-F）。综上可见，该模型稳定性较好，仪器分析和数据结果均具有较高的可靠性。

2.2 不同瓠瓜品系间差异代谢物筛选和鉴定

根据OPLS-DA 生成的第1 主成分变量重要性值投影值（variable importance in the projection，VIP）以及t检验的P值来筛选组间的差异代谢物（VIP ≥1，且P＜0.05）。VIP 值越大，分类贡献越大，越能表明差异代谢物对不同瓠瓜品系的影响强度。由表1 可知，I77 与Nanxiu 果实中差异代谢物有66 种，与Nanxiu 相比，在I77 中显著上调的代谢物数目为31 种，包括氨基酸及其衍生物8 种、酚酸类3 种、黄酮8 种、生物碱3 种以及脂质9 种；显著下调的化合物数目为35 种，包括氨基酸及其衍生物2 种、酚酸类7 种、核苷酸及其衍生物2 种、黄酮11 种、生物碱2 种、萜类2 种以及脂质9 种（表1）。再利用SPSS 22.0 进行变化差异倍数（FC）分析，FC 值≥4 的共有6 种，分别为9-羟基-10，12-十八碳二烯酸、9S-羟基-10E，12E-十八碳二烯酸、13-羟基-9，11-十八碳二烯酸、月桂酸、谷胱甘肽和L-瓜氨酸。

表1 I77 与Nanxiu 果实中差异代谢物

续表

2.3 差异代谢物聚类分析

采用聚类分析方法对不同品系瓠瓜果实中的差异代谢物进行分析，图中颜色表示含量，红色表示含量高表达，绿色表示含量低表达。结果如图2 和表1 所示，差异代谢物在I77 与Nanxiu中的含量明显区分，I77 品系中的9-羟基-10，12-十八碳二烯酸、9S-羟基-10E，12E-十八碳二烯酸、13-羟 基-9，11-十八碳二烯酸、月桂酸、谷胱甘肽、L-瓜氨酸、9，10-环氧十八碳二烯酸、N′，N″″，N″″′-对香豆酰阿魏酰咖啡酰亚精胺、二氢鞘氨醇以及12，13-环氧十八碳二烯酸等代谢物的含量相对较高。Nanxiu 品系中的黄嘌呤、LPC（18：1）、单酰甘油酯（酰基18：2）异构1、溶血磷脂酰乙醇胺18：1（2n 异构）、4-O-（6'-O-葡萄糖-对香豆酰基）-4-羟基苄醇、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、6-O-对香豆酰基-β葡萄糖、对香豆酸甲酯、毛蕊糖甙、大车前苷、芍药花青素和盐酸多巴胺含量较高。

2.4 差异代谢物主成分分析

采用标准化的数据和SPSS 22.0 降维模块中因子分析功能，对I77 和Nanxiu 中主要差异代谢物进行主成分分析（PCA）。由表2 可知，前5 个主成分累积贡献率达到100.00%，同时计算得到了5个主成分的因子载荷矩阵，其中，第1 主成分的方差贡献率为73.34%，具有较大载荷值的物质为：N-乙酰-L-亮氨酸、12，13-环氧十八碳二烯酸、木犀草素-7-O-芸香糖苷、溶血磷脂酰乙醇胺14：0等；第2 主成分的方差贡献率为12.30%，芍药花青素、葫芦素d-乙酰葡萄糖、23，24-二氢葫芦素E O-葡萄糖苷等具有较大的载荷值；第3 主成分的方差贡献率为5.86%，具有较大载荷值的物质为溶血磷脂酰乙醇胺16：0、3-〔（2-氨基乙氧基）（羟基）磷酸〕氧基-2-羟丙基棕榈酸酯、L-焦谷氨酸等；第4 主成分的方差贡献率为5.10%，槲皮素7-O-丙二酰基己糖基-己糖苷、4-O-葡糖基-4-羟基苯甲酸等具有较高的载荷值；第5 主成分的方差贡献率为3.40%，C-己糖基-芹菜素O-己糖苷-O-阿魏酰己糖苷、月桂酸等具有较高载荷值。

表2 瓠瓜品质评价因子的特征值、贡献率及累积贡献率

2.5 差异代谢物代谢途径分析

基于KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据平台对筛选出的差异代谢物进行代谢通路富集分析，其中Rich factor 为差异表达的代谢物中在对应通路中的个数与该通路检测注释到的代谢物总数的比值，该值越大表示富集程度越大，P值越接近于0，表示富集越显著。如图3 所示，点的大小代表富集到相应通路上的差异显著代谢物个数，点的颜色表示代谢通路的P值。KEGG 通路富集分析发现差异代谢物主要显著富集的代谢途径有4 条，分别为酪氨酸代谢、黄酮类生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成以及次生生物代谢。

3 讨论与结论

鲜味在中国饮食文化中占有重要的地位，其最早见于宋朝林洪的《山家清供》中对竹笋“其味甚鲜”的描述，至明清时期，鲜味的概念已经为人们所普遍接受。鲜味是一种复杂的综合味感，它是人类进食时产生的一种令人满足、愉悦的鲜美感觉，是人们在饮食中一直努力追求的美味之一。目前鲜味相关研究非常缺乏。尤其是对于大部分的蔬菜作物，尚不清楚影响其鲜味的主要关键物质。

近年来，广泛靶向代谢组学成为鉴定影响果实品质因子的强有力工具，成功应用于不同作物中（Tamura et al.，2018；Wang et al.，2018a，2018b；章智钧 等，2020）。本试验使用UPLC-MS/MS 广泛靶向代谢组学对2 个口感品尝鲜味差异显著的瓠瓜品系进行分析，共筛选到66 种显著差异物质。通过对I77 与Nanxiu 不同品系间差异代谢物进行聚类热图比较、差异倍数（FC ≥4）分析以及主成分分析，结果表明：瓠瓜果实鲜味关键物质，主要包括脂类（9-羟基-10，12-十八碳二烯酸、9S-羟基-10E，12E-十八碳二烯酸、13-羟基-9，11-十八碳二烯酸、月桂酸、12，13-环氧十八碳二烯酸、溶血磷脂酰乙醇胺14：0）、氨基酸及其衍生物类（谷胱甘肽、L-瓜氨酸、N-乙酰-L-亮氨酸）以及黄酮类（木犀草素-7-O-芸香糖苷）等。目前越来越多的研究提出并证实了氨基酸及其衍生物类是提供瓠瓜鲜味的主要物质成分之一（刘天天 等，2018；李锐 等，2019；于芳珠 等，2020）。脂类物质能起到复合调味剂的作用，可增强口感、风味和营养成分，使人增强食欲（缪杰和马惠香，2005）。木犀草素类黄酮化合物具有抗菌和抗氧化活性功能（宋雪娇 等，2015），可预防果实褐化，保持果实品质。因此推测氨基酸及其衍生物类、脂类和黄酮类等物质可能综合影响瓠瓜鲜味品质。