低温胁迫下不同耐寒性叶用芥菜的生理差异分析

王玉贤 姚培杰 袁颖辉 杨文杰 万正杰*

（1 华中农业大学园艺林学学院，湖北武汉 430070；2 中国农业大学农学院，北京 100193）

芥菜（Brassica junceaCoss.）是起源于中国的特色蔬菜，为十字花科芸薹属常异花授粉的一年或两年生草本植物。其中，叶用芥菜包括分蘖芥、大叶芥等11 个变种，在西南、华南、华中、华东等地种植约100 万hm2（万正杰 等，2018）。叶用芥菜喜冷凉，生长适温为15～22 ℃，温度低于12 ℃时生长受阻。我国长江流域以及西南地区芥菜类蔬菜以越冬栽培或者高海拔栽培为主，冬季极端气候（雪灾和冻害）的频繁发生和高海拔冷凉气候极大地影响了芥菜的生长发育，因此筛选耐寒芥菜资源，培育耐寒芥菜新品种是我国芥菜类蔬菜育种的主要目标。目前芥菜的研究多集中在叶色、叶形、抗病性、耐旱性及雄性不育等遗传和育种领域，有关芥菜耐寒的生理特性研究鲜有报道。

低温胁迫是非生物胁迫因子之一，严重影响植物的生长发育。植株在低温胁迫下生长缓慢，叶片萎蔫失绿，结实率下降，产量和品质双重降低（马骊 等，2016；张磊 等，2017）。而植物会启动一系列响应机制来应对低温环境，涉及植物细胞膜结构和功能的变化，细胞内电子传递、酶活性、原生质体的变化以及一些超微结构如类囊体的磷酸化等（Theocharis et al.，2012）。姚悦梅等（2017）研究表明，低温胁迫下羽衣甘蓝叶片的相对电导率、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量显著增加。杨碧云等（2019）研究表明，低温胁迫下紫色普通白菜（小白菜）的PS Ⅱ光化学活性受到抑制、光合速率下降，影响其光合作用能力。白阳阳（2017）研究表明，可通过增强光合性能、抗氧化能力及渗透调节能力来提高甜菜幼苗自身耐寒性。关于芥菜在低温胁迫下的生理变化未见报道，但探明其生理机制对选育耐寒芥菜新品种却尤为重要。

本试验通过对400 份芥菜自交系的田间筛选，得到2 个具有明显耐寒性差异的叶用芥菜自交系。以这2 个自交系为研究对象，分别进行4 ℃低温和22 ℃常温处理，分析其在生长情况、光合作用能力、抗氧化酶活性、渗透调节物质含量等方面的差异，以期为选育耐寒叶用芥菜新品种提供理论依据和实践支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从全国各地芥菜栽培区和科研院所收集芥菜自交系共400 份，于2017年9 月25 日在华中农业大学蔬菜育种基地播种，小区面积2.5 m2，随机区组排列，3 次重复。2018年1 月8—11 日出现连续低温天气，最低气温达-7 ℃（图1），田间400 份芥菜自交系表现出明显的生长差异（图2），其中大叶芥自交系18J381（图2-A）叶片萎蔫、皱缩，甚至腐烂，不耐低温；分蘖芥自交系18J380（图2-F）植株挺拔，叶片舒展，叶色微黄，耐寒性较强。18J381 来源于广东省地方品种广东客家芥，18J380来源于浙江省地方品种细叶排菜。这2 个自交系的耐寒性及生长情况差异明显，选用于后续生理指标差异分析。

1.2 试验方法

试验于2018年11 月至2019年3 月在华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室进行。18J381 和18J380 种子分别播于装有育苗基质（泥炭∶园艺蛭石∶珍珠岩=2V∶1V∶1V）的营养钵（高8 cm，上口径7 cm，下口径5 cm）中，压穴播种深度0.3 cm，每穴2 粒。育苗钵置于组织培养室内，环境条件为：光周期16 h/8 h（光照/黑暗），光照强度500μmol·m-2·s-1，空气相对湿度70%，出苗前温度25 ℃，出苗后22 ℃；出苗后及时间苗，加强苗期管理，待幼苗第3 片真叶完全展开、第4 片真叶刚长出时，选取长势整齐一致的幼苗移至人工气候箱中进行低温胁迫处理。低温处理温度为4 ℃，对照温度为22 ℃，光照条件和相对湿度与组织培养室相同。每处理幼苗24 株，3 次重复。

低温处理3 d 后，2 个叶用芥菜自交系的幼苗长势出现明显差异，拍照记录各处理幼苗的形态，并取样测定各项生理指标。

1.3 项目测定

每处理随机选取4 株幼苗，用去离子水洗净、擦干，从根茎部剪断，利用天平称量地上部鲜质量，记为W1；然后置于80 ℃烘箱烘干至恒重，称量干质量，记为W2。

每处理随机选择3 株幼苗，取自下往上数第3片真叶，采用电导仪法测定相对电导率（王学奎，2006），采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量（王学奎和黄见良，2015），采用考马斯亮蓝G-250 法测定可溶性蛋白含量（李合生，2000），采用茚三酮法测定游离脯氨酸含量（孔祥生和易现锋，2008）；采用氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性（Giannopolitis &Ries，1977），采用愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性（李合生，2000），采用紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT）活性（王学奎，2006），采用紫外比色法测定抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性（中国科学院上海植物生理研究所和上海市植物生理学会，1999）；暗适应30 min 后，采用Imaging-PAM 荧光成像仪测定光系统Ⅱ最大光化学量子产量（Fv/Fm）、实际光化学量子产量（ΦPS Ⅱ）、非光化学猝灭系数（NPQ）和光化学猝灭系数（qP）（Lu et al.，2003）。

1.4 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2010 软件整理和计算，并进行单因素方差分析。其中，以百分数为结果的数据先进行反正弦转换，再进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对不同耐寒性叶用芥菜幼苗生长的影响

如图3 所示，4 ℃低温处理3 d 后不耐寒的大叶芥自交系18J381（广东客家芥）叶片萎蔫、下垂，且叶片发黄，老叶受损害程度较重；耐寒性强的分蘖芥自交系18J380（细叶排菜）植株依旧挺拔直立，未出现叶片失水萎蔫情况，叶片略有泛黄迹象。2 个叶用芥菜自交系的实验室低温处理表现与田间表现一致。

2.2 低温胁迫对不同耐寒性叶用芥菜幼苗相对含水量、相对电导率和MDA 含量的影响

从表1 可以看出，低温胁迫下2 个叶用芥菜自交系的幼苗相对含水量均显著下降；与各自对照相比，18J381 和18J380 相对含水量分别下降了3.13和2.22 百分点，不耐寒的大叶芥自交系18J381 相对含水量的降低幅度大于耐寒性强的分蘖芥自交系18J380。说明低温胁迫下耐寒性强的叶用芥菜的持水能力要强于不耐寒的叶用芥菜，这与生长形态观察结果一致。低温胁迫下18J381 叶片相对电导率和MDA 含量均显著升高，分别比相应对照升高了20.24 百分点和25.0%。而18J380 的叶片相对电导率虽有上升，但与相应对照差异不显著；MDA 含量比相应对照显著增加，增幅45.5%，表明低温胁迫导致2 种叶用芥菜幼苗的细胞膜均受损；与不耐寒的18J381 相比，耐寒性强的18J380 受损程度较轻，细胞内含物外渗较少。

表1 低温胁迫对不同耐寒性叶用芥菜幼苗相对含水量、相对电导率和MDA 含量的影响

2.3 低温胁迫对不同耐寒性叶用芥菜幼苗叶绿素荧光参数的影响

叶绿素荧光参数能够更为直观和准确地反映植物光合系统的工作效率。如图4 所示，低温胁迫导致18J381 叶片光合能力不均匀下降，与叶片中央相比，叶缘处荧光成像对应的参数值变化显著，光合作用的抑制尤为严重。从表2 可以看出，与相应对照相比，低温胁迫下18J381 的光系统Ⅱ最大光化学量子产量（Fv/Fm）、实际光化学量子产量（ΦPS Ⅱ）、非光化学猝灭系数（NPQ）和光化学猝灭系数（qP）均显著下降；而18J380 的ΦPS Ⅱ和qP 虽与相应对照相比显著下降，但降幅小于18J381，Fv/Fm 则与相应对照差异不显著，NPQ值升高。表明低温胁迫下不耐寒的大叶芥自交系18J381 光合能力受到的抑制更为严重。

2.4 低温胁迫对不同耐寒性叶用芥菜幼苗抗氧化酶活性的影响

从表3 可以看出，与各自对照相比，低温胁迫下18J380 的SOD、POD 和CAT 活性均显著上升，分别增加了46.93%、45.65%和18.59%。而18J381的SOD 活性无显著差异；POD 和CAT 活性显著上升，且上升幅度高于18J380；APX 活性的上升幅度亦高于18J380，但与其相应对照无显著差异。以上结果表明18J380 的SOD 活性显著上升对于耐寒性的增强起着重要作用。

2.5 低温胁迫对不同耐寒性叶用芥菜幼苗可溶性蛋白和游离脯氨酸含量的影响

从表4 可以看出，低温胁迫下18J381 的可溶性蛋白和游离脯氨酸含量均比相应对照显著增加；而18J380 的可溶性蛋白含量与相应对照无显著差异，游离脯氨酸含量的增加幅度明显高于18J381。说明低温胁迫下耐寒性强的18J380 通过积累更多的游离脯氨酸来进行渗透调节，从而提高自身耐寒性。

表4 低温胁迫对不同耐寒性叶用芥菜幼苗可溶性蛋白和游离脯氨酸含量的影响

3 结论与讨论

本试验结果表明，4 ℃低温胁迫下不耐寒的大叶芥自交系18J381 相对含水量下降幅度比耐寒性强的分蘖芥自交系18J380 大，这与幼苗的生长状况表现一致。但是18J381 的叶面积比18J380 大，因此散失的水分可能较多，故还需要测定叶片蒸腾速率等指标进一步明确缘由。低温胁迫对2 种叶用芥菜幼苗的细胞膜造成了一定的损伤，MDA 含量和相对电导率均呈上升趋势，但18J381 的相对电导率上升幅度更大，细胞内含物外渗较多，细胞膜的结构和功能受到更加严重损伤。

叶绿素荧光参数动力学技术是一种测定植物光合系统工作效率的方法，其参数值可以反映植物光系统吸收、转化、传递、利用光能的情况（王晓黎 等，2011）。Fv/Fm 代表植物潜在的光合作用能力，ΦPS Ⅱ代表植物的实际光合效率，NPQ 反映植物的光保护能力大小，qP 反映植物光合活性的高低。研究表明，植物在逆境中Fv/Fm、ΦPS Ⅱ和qP 值下降，而为了避免过剩光损伤NPQ 值会升高（Gorbe &Calatayud，2012；许耀照 等，2019）。本试验中，低温胁迫下耐寒性强的18J380 的Fv/Fm 和NPQ 与相应对照差异不显著，且NPQ 值升高；而不耐寒的18J381 的4 个参数均比对照显著下降，尤其是NPQ 值下降说明低温直接导致其热耗散保护能力下降。Fv/Fm 值下降表明植物在低温下发生光抑制（张渝洁，2008），也表明发生光抑制的点位于PS Ⅱ（张立涛 等，2009），PS Ⅱ反应中心的失活导致电子传递活性大幅度降低，植物的光合作用机制遭到破坏。因此低温抑制18J381 光合活性的原因可能是低温抑制了光合作用酶的活性，PS Ⅱ复合物需要同化的光能增加，而植株本身将过剩光能转化为热能耗散的能力下降，电子传递链产生过剩的电子，累积较多的活性氧，对反应中心色素蛋白造成损伤，使PS Ⅱ的活性受到抑制（张磊 等，2017）。

抗氧化酶系统是植物抗逆研究中最为普遍的指标。植物在逆境胁迫中会产生过多的活性氧对自身造成危害，活性氧清除系统的工作效率与抗氧化酶的活性有关（Keutgen &Elke，2008）。本试验结果表明，低温胁迫下耐寒性强的18J380 的SOD 活性显著升高，上升幅度高于不耐寒的18J381，这与在黄瓜和甘蓝幼苗上的研究结果一致（秦文斌 等，2018；Lee &Lee，2000）；而18J381 的POD 和CAT活性上升幅度高于18J380，与前人研究的西葫芦叶片酶活性升高幅度越大植株耐寒性越强的规律相反（毛丽萍 等，2009），这可能是由于酶活性的变化较复杂，受取样时间和环境等因素的影响，今后将对这两个指标与芥菜耐寒性的关系进一步进行试验验证。

低温环境下植物细胞内会生成大量的渗透调节物质，来缓解或避免细胞失水和细胞冷凝（Per et al.，2017）。可溶性蛋白和游离脯氨酸都具有较强的亲水性，能增加细胞的持水能力，保护细胞结构不受损伤。本试验中，低温胁迫下2 个叶用芥菜自交系幼苗的可溶性蛋白和游离脯氨酸含量均升高，这与在白菜型冬油菜和甘蓝型油菜上的研究结果一致（李世成 等，2007；蒲媛媛，2010）。18J380 可溶性蛋白含量的增加幅度低于18J381，但游离脯氨酸含量的增加幅度明显高于18J381，说明其主要是通过积累游离脯氨酸来增强对低温环境的适应性。

综上，与不耐寒的大叶芥自交系18J381 相比，耐寒性强的分蘖芥自交系18J380 能够更有效地响应低温胁迫，增强抗氧化酶活性、提高渗透调节能力以减轻自身细胞损伤，维持较强的光合作用能力。推测相对电导率、叶绿素荧光参数Fv/Fm 和NPQ 值、SOD 活性以及游离脯氨酸含量可作为初步筛选耐寒芥菜的生理指标。今后将对本试验筛选出的叶用芥菜耐寒生理指标在其他类型叶用芥菜品种中展开验证，以进一步明确叶用芥菜耐寒性生理机制的规律性和普遍性。