miR-182-5p在膀胱癌中的表达及其机制

郝朝辉 张楠 陈昆 葛雷

作者单位：郑州人民医院泌尿外科（郑州市450000）

膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤，由于初期发病隐匿，许多患者确诊时已出现癌细胞远处转移，导致预后不良[1]。研究发现包括miR-182 在内的多种miRNA在膀胱癌组织中异常表达，与膀胱癌的发生发展及预后密切相关[2]。miR-182 通过调控不同的靶点参与乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤的发生发展[3-4]。目前，关于miR-182 在膀胱癌细胞中作用机制的研究较少。本研究旨在对膀胱癌组织中miR-182-5p 及FOXO3的表达进行分析，预测并验证miR-182-5p 与FOXO3的靶向关系，分析抑制miR-182-5p 对膀胱癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响，以期为膀胱癌的靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料及组织标本 选取2017年6月至2019年6月64 例于郑州人民医院经手术切除并经病理学证实为膀胱癌的患者的临床病理资料及组织标本，术前均未行放疗、化疗及其他肿瘤相关治疗。癌组织及癌旁组织标本迅速置于液氮中冻存。根据膀胱癌组织中miR-182-5p 和FOXO3 的表达水平，将64 例膀胱癌患者分别分为miR-182-5p 高表达组和miR-182-5p 低表达组、FOXO3 高表达组和FOXO3 低表达组。本研究经本院医学伦理学委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.1.2 细胞及主要试剂 膀胱癌T24 细胞和正常膀胱细胞SV-HUC-1 均购自北京北纳联创生物技术研究院；DMEM 培养基购自美国Gibco 公司；胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素双抗均购自美国Invitrogen 公司；miR-182-5p 模拟物、miR-182-5p 抑制剂及其相应的阴性对照物（miR-NC）均购自广州锐博生物有限公司；Lipofectamine 2000 试剂购自美国Invitrogen 公司；SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒购自日本Takara 公司；FOXO3 单克隆抗体和HRP 标记的羊抗鼠的IgG购自英国Abcam 公司；双荧光素酶报告检测试剂盒购自美国Promega 公司。

1.1.3 随访 对所有术后患者进行随访，随访截止时64 例膀胱癌患者中11 例死亡，生存率为82.81%（53/64）。随访时间截至2020年6月。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 T24 和SV-HUC-1 细胞采用含有10% FBS，100 U/mL 青霉素/100 mg/mL 链霉素的DMEM 培养基，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中进行培养。将T24 细胞接种至6 孔板中，分为空白组，miR-NC 组（转染miR-NC）和miR-182-5p 抑制剂组（转染miR-182-5p 抑制剂）。按照Lipofectamine 2000 试剂说明书进行转染，6 h 后更换培养基，常规培养48 h 进行后续实验。

1.2.2 实时荧光定量PCR 采用Trizol 试剂提取组织及细胞总RNA，逆转录为cDNA。采用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂进行实时荧光定量PCR（RTqPCR）反应。反应程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃15 s，共40 个循环。分别以U6 和β-actin 为内参，采用2−ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。其中ΔCt=Ct目的基因−Ct内参，ΔΔCt=ΔCt实验组−ΔCt对照组。

1.2.3 Western blot 实验 采用RIPA 裂解液提取组织和细胞总蛋白。取适量的蛋白样品进行SDSPAGE，转膜后，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。孵育FOXO3 单克隆抗体（1:1 000），4 ℃过夜。羊抗鼠的IgG 二抗（1:2 000）室温孵育2 h。滴加增强型化学发光液，显影、定影处理。以β-actin 为内参，采用Image-J 软件分析条带灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.2.4 双荧光素酶报告基因实验 将T24 细胞接种到24 孔板中，培养24 h 后，分别将miR-182-5p 模拟物或miR-NC 及psiCHECK-FOXO3-野生型质粒或psiCHECK-FOXO3-突变型质粒共同转染至T24 细胞。48 h 后，采用双荧光素酶报告检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.2.5 CCK-8 实验 将转染48 h 后的细胞，调整细胞浓度为5×104/mL，取0.1 mL 接种于96 孔板，每组设3 个复孔。分别培养24、48、72、96 h 后，加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育4 h，在酶标仪450 nm 波长处检测各孔的吸光度。

1.2.6 Transwell 实验 将转染后的细胞使用不含FBS 的DMEM 培养基重悬，调整细胞浓度为1×105/mL，取0.2 mL 细胞悬液加入上室，下室中加入含有10% FBS 的培养液，培养24 h。侵袭至下室的细胞使用甲醇固定，结晶紫染色，随机选取5 个视野计数穿膜细胞数。

1.2.7 流式细胞术 收集转染48 h 后的细胞，PBS清洗后，使用结合缓冲液重悬细胞并调整细胞浓度。100 μL 细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC 混匀，室温避光15 min，上机前5 min 加入PI 溶液5 μL，混匀。采用CytoFLEX 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。

1.3 统计学分析

采用SPSS19.0 软件进行统计学分析。计量资料采用±s表示，不同时间点的多组间比较采用重复测量分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。计数资料采用χ2检验，采用Kaplan-Meier 法进行生存分析并行Log-rank 检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌组织中miR-182-5p 和FOXO3 的表达

miR-182-5p在膀胱癌组织中的表达量为2.27±0.66，显著高于癌旁组织的1.04±0.36，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.001，图1A）。与癌旁组织相比，膀胱癌组织中FOXO3 的表达水平显著降低（图1B～D）。膀胱癌组织中miR-182-5p 的表达水平与FOXO3呈负相关（r=-0.601,P＜0.001，图1E）。

图1 膀胱癌组织中miR-182-5p 和FOXO3 的表达

2.2 miR-182-5p 和FOXO3 与膀胱癌患者临床病理特征的关系

miR-182-5p、FOXO3 与患者临床病理特征见表1，其中肿瘤大小、TNM 分期及淋巴结转移在miR-182-5p 高表达组和低表达组中差异具有统计学意义（P＜0.05），而肿瘤大小、分化程度、TNM 分期及淋巴结转移在FOXO3 高表达组和低表达组中差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 miR-182-5p、FOXO3 与膀胱癌患者临床病理特征的关系（续表1）

表1 miR-182-5p、FOXO3 与膀胱癌患者临床病理特征的关系

2.3 miR-182-5p 和FOXO3 与膀胱癌预后的关系

miR-182-5p 高表达组患者的生存率显著低于低表达组（χ2=4.286，P=0.038），而FOXO3高表达组患者的生存率显著高于低表达组（χ2=8.205，P=0.004，图2）。

图2 Kaplan-Meier 生存曲线分析miR-182-5p 和FOXO3 与膀胱癌患者预后的相关

2.4 抑制miR-182-5p 上调FOXO3 的表达

T24 细胞中miR-182-5p 表达量为3.08±0.12，显著高于SV-HUC-1 细胞的1.02±0.04，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。转染miR-182-5p 抑制剂能够抑制miR-182-5p 的表达（P＜0.05，图3A）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，转染psiCHECKFOXO3-野生型质粒后，miR-182-5p 模拟物组荧光素酶的活性低于miR-NC 组（P＜0.05，图3B）。与空白组和miR-NC 组相比，转染miR-182-5p 抑制剂后，T24 细胞中FOXO3 的表达水平明显升高（P＜0.05，图3C～E）。

图3 miR-182-5p 抑制剂上调FOXO3 的表达

2.5 抑制miR-182-5p 表达对细胞增殖的影响

与空白组和miR-NC 组相比，miR-182-5p 抑制剂组细胞的增殖活性显著降低（P＜0.05，图4）。

图4 CCK-8 实验检测细胞的增殖活力

2.6 抑制miR-182-5p 表达对细胞侵袭的影响

miR-182-5p 抑制剂组侵袭细胞的数量明显低于空白组和miR-NC 组（P＜0.05，图5）。

图5 Transwell 实验检测细胞的侵袭能力

2.7 抑制miR-182-5p 表达对细胞凋亡的影响

与空白组和miR-NC 组相比，miR-182-5p 抑制剂组的细胞凋亡率显著上升（P＜0.05，图6）。

图6 流式细胞术检测细胞的凋亡情况

3 讨论

miR-182-5p 参与多种恶性肿瘤的发生发展，Luo等[5]研究发现肺鳞癌中的miR-182-5p 高表达，并可作为肺鳞癌发生发展的生物标志物，另有研究发现miR-182-5p 靶向Bcl-2 抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移[6]。Wei 等[7]利用miRNA 芯片分析发现，在膀胱癌组织中miR-182-5p 表达上调。Pignot 等[8]研究提示，miRNA-182-5p 表达上调可能与膀胱癌的浸润性有关。但也有研究表明，在膀胱癌组织中miR-182 表达下调，通过调控Cofilin1 抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭[9]。因此，在膀胱癌组织中关于miR-182-5p 表达及作用存在一定的争议。本研究结果发现，miR-182-5p在膀胱癌组织和T24 细胞中高表达，与肿瘤大小、TNM 分期、淋巴结转移及不良预后有关，抑制miR-182-5p 表达能够抑制T24 细胞的增殖和侵袭，促进其凋亡，提示miR-182-5p 能够促进膀胱癌细胞的增殖和侵袭，抑制细胞凋亡，在膀胱癌的发生发展中发挥促癌作用。

miR-182-5p 能够靶向调控下游靶基因在多种恶性肿瘤中发挥促癌作用，Zhao 等[10]研究发现抑制miR-182-5p 表达可靶向上调PTEN 从而抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭，Chang 等[11]研究发现miR-182-5p 靶向调控FBXW7 和FBXW11，促进肺癌细胞增殖，抑制其凋亡，发挥肿瘤启动子的作用，另有研究发现miR-182-5p 能够抑制FOXO3a 表达调控肺癌细胞的增殖、侵袭和凋亡[12]。FOXO3 是FOX 家族的成员之一，参与调控癌细胞的增殖、分化、凋亡等行为[13]。杨晗杰等[14]研究发现，在膀胱癌组织中FOXO3 低表达，与患者的预后不良密切相关。Chen 等[15]研究指出，在膀胱癌中miR-182-5p 表达上调，FOXO3a 表达下调，与膀胱癌的预后密切相关。本研究结果同样发现，FOXO3 在膀胱癌组织中低表达，与患者的预后不良有关，且抑制miR-182-5p 能够上调FOXO3 表达。因此推测miR-182-5p 促进膀胱癌细胞的增殖和侵袭、抑制其凋亡可能是通过负调控FOXO3 实现的。

综上所述，在膀胱癌组织中miR-182-5p 高表达、FOXO3 低表达，均与膀胱癌患者的预后不良有关。miR-182-5p 促进膀胱癌细胞的增殖和侵袭，抑制其凋亡，可能与负调控FOXO3 表达有关。miR-182-5p 可能是膀胱癌潜在的治疗靶点。