气相色谱法分析甾烯醇

肖苏熠，孙长恩，阚晓丽

（国家农药产品质量监督检验中心，江苏南京 210029）

甾烯醇（C29H50O）一般从棉籽内提取，还可以从食用油脂精炼过程产生的植物油脱臭馏出物中提纯。甾烯醇可以抑制病毒复制，通过降低植物核酸酶的活性，抑制合成病毒，是天然的抑菌药物。甾烯醇通过改变寄主细胞的代谢使病毒无法增殖，从而对水稻矮缩病、小麦病毒病、烟草病毒病、蔬菜病毒病等均有防治效果。采用气相内标法定量分析其含量，具有操作简便、精确度高、定量准确等优点。

1 材料与方法

1.1 试剂

甾烯醇标准品，陕西上格之路生物科学有限公司；正丁醇、胆固醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与条件

Agilent 7890A 型气相色谱仪，安捷伦科技有限公司。30 m×0.32 mm（i.d.）DB-1 毛细管柱，膜厚0.25 μm（或具同等效果的色谱柱）；柱室： 180 ℃保持1 min，以10 ℃/ min 升温速率升到270 ℃，保持15 min，气化室：290 ℃，检测器室： 300 ℃； 载气为N2：2.0 mL/min；燃烧气为H2，35 mL/min；助燃气为空气，400 mL/min；分流比：10 ∶ 1；微量进样器：10 μL。

以上操作参数为典型参数，可根据不同仪器特点，对操作参数进行适当调整，以期获得最佳效果。

1.3 样品制备

1.3.1 内标溶液的配制

称取胆固醇0.40 g（精确至0.01 g）于100 mL 容量瓶中，用正丁醇溶解并稀释至刻度，摇匀备用。

1.3.2 标样溶液的配制称取0.03 g（精确至0.000 1 g）甾烯醇标样于25 mL 容量瓶中，准确加入5 mL 内标物溶液，用正丁醇稀释至刻度，摇匀。

1.3.3 试样溶液的配制

1.3.3.1 甾烯醇母药试样溶液的配制

称取甾烯醇母药样品3 g 于25 mL 容量瓶中，准确加入5 mL 内标物溶液，用正丁醇稀释至刻度，摇匀。

1.3.3.2 甾烯醇微乳剂试样溶液的配制

称取甾烯醇微乳剂样品20 g 于50 mL 容量瓶中，准确加入5 mL 内标物溶液，摇匀。

1.4 方法学验证

1.4.1 线性关系

分别称量甾烯醇标样0.2011 g、15.41 mg、29.92 mg、40.93 mg、60.61 mg 于1～5 号容量瓶中（1 号为200 mL，2～5 号为25 mL），1 号加正丁醇定容至刻度、摇匀，得甾烯醇母液，2～5 号分别加5 mL 内标溶液，加入正丁醇定容至刻度，摇匀。准确移1 号容量瓶溶液中甾烯醇母液5 mL 于6 号25 mL 容量瓶中，加5 mL 内标溶液，加入正丁醇定容至刻度，摇匀。

配制甾烯醇5 个不同浓度的线性相关溶液，分别标记为STD1～STD5。在“1.2”操作条件下，待仪器稳定后，按照STD1 至STD5 的顺序测定每个溶液中甾烯醇与内标物的峰面积比，取两次测定的平均结果。

1.4.2 精密度

称取甾烯醇母药样品3.0 g 于25 mL 容量瓶中，准确加入5 mL 内标物溶液,用正丁醇稀释至刻度，摇匀。得精密度溶液，分别标记为甾烯醇母药-A1～甾烯醇母药-A5。

称取甾烯醇微乳剂样品20 g 于50 mL 容量瓶中，准确加入5 mL 内标物溶液，摇匀，得精密度溶液，分别标记为甾烯醇微乳剂-A1～甾烯醇微乳剂-A5。

以甾烯醇线性相关溶液STD3 为标样溶液，在“1.2”操作条件下，待仪器基线稳定后，按照标样溶液、精密度溶液、精密度溶液、标样溶液的顺序进行测定。

1.4.3 准确度

称取甾烯醇标样0.233 0 g 于200 mL 容量瓶中作为甾烯醇母液，称取甾烯醇母药样品1.5 g 于25 mL容量瓶中，准确加入5 mL 内标物溶液和10 mL 甾烯醇母液及5 mL 正丁醇，摇匀。分别取上述母液于5个进样瓶中，标记为TK-B1～TK-B5。

称取甾烯醇标样0.151 1 g 于200 mL 容量瓶中作为甾烯醇母液，称取甾烯醇微乳剂样品10 g 于25 mL容量瓶中，准确加入5 mL 内标物溶液和10 mL 甾烯醇母液，摇匀，标记为ME-B1～ME-B5。

以甾烯醇线性相关溶液STD3 为标样溶液，在“1.2”操作条件下，待仪器基线稳定后，按照标样溶液、准确度溶液、准确度溶液、标样溶液的顺序进行测定。

1.5 计算

将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中甾烯醇与内标物的峰面积比分别进行平均。试样中甾烯醇的质量分数按公式（1）计算。

式（1）中，ω1为试样中甾烯醇的质量分数，%；r2为试样溶液中甾烯醇与内标物峰面积比的平均值；m1为标样的质量，g；ω为标样中甾烯醇的质量分数，%；r1为标样溶液中甾烯醇与内标物峰面积比的平均值；m2为试样的质量，g。

2 结果与分析

2.1 线性关系

以甾烯醇与内标物的质量比为横坐标，峰面积比为纵坐标绘制标准曲线，结果见图1。从图1 可以看出，当甾烯醇与内标物质量比在0.178 8～2.153 9 之间（甾烯醇质量浓度201.2～242 4.4 mg/L），与相应的甾烯醇与内标物峰面积比之间呈现良好的线性关系，计算得回归方程为y=0.993 1x-0.009 8，相关系数r=1，可以满足定量分析要求。本方法中甾烯醇标样质量浓度为1 196.8 mg/L（进样体积1 μL）。

2.2 甾烯醇的气相方法精密度试验

图1 甾烯醇与内标物峰面积比与质量比线性关系图

精密度结果见表1～4。从表2 和表3 可以看出，甾烯醇母药中甾烯醇质量分数测定结果的RSD为2.47%，小于修改的Horwitz 公式2(1-0.51gC)×0.67=3.11（其中C为样品中有效成分质量分数的平均值，以小数计；如20.12%，C=0.201 2），表明甾烯醇分析方法精密度的测定结果符合要求。从表3 和表4 可以看出，甾烯醇微乳剂中甾烯醇质量分数测定结果的RSD为1.22%，小于修改的Horwitz 公式2(1-0.51gC)×0.67=4.11，表明甾烯醇分析方法精密度的测定结果符合要求。

2.3 甾烯醇的气相方法准确度试验

准确度结果见表4～5。从表4 可以看出，甾烯醇母药中甾烯醇平均回收率为100.52%，具有良好的准确度；从表5 可以看出，甾烯醇微乳剂中甾烯醇平均回收率为102.60%，具有良好的准确度。

2.4 原始图谱

试验中气相色谱图如图2～12 所示。

表1 甾烯醇母药精密度试验结果

表2 甾烯醇母药中甾烯醇质量分数数据统计 单位：%

表3 甾烯醇微乳剂中甾烯醇精密度试验结果

表4 甾烯醇微乳剂中甾烯醇质量分数数据统计 单位：%

表4 甾烯醇母药回收率试验结果

表5 甾烯醇微乳剂回收率试验结果

图2 空白气相色谱图（甾烯醇标样无内标物）

图3 空白气相色谱图（甾烯醇微乳剂样品，无内标物）

图4 甾烯醇母药溶液（无内标物）气相色谱图

图5 甾烯醇线性溶液STD1 气相色谱图

图6 甾烯醇线性溶液STD5 气相色谱图

图7 甾烯醇微乳剂精密度溶液ME-A1 气相色谱图

图8 甾烯醇微乳剂精密度溶液ME-A5 气相色谱图

图9 甾烯醇母药精密度溶液TK-A1 气相色谱图

图10 甾烯醇母药精密度溶液TK-A5 气相色谱图

图11 甾烯醇微乳剂准确度溶液ME-B1 气相色谱图

图12 甾烯醇微乳剂准确度溶液ME-B5 气相色谱图

3 结论

甾烯醇与内标物质量比在0.178 8～2.153 9（甾烯醇质量浓度201.2～2 424.4 mg/L），与相应的甾烯醇与内标物峰面积比之间呈现良好的线性关系，满足定量分析要求，此气相色谱法分析甾烯醇含量简单便捷；从甾烯醇微乳剂和母药溶液中测定甾烯醇含量，样品精密度和准确度较好，符合分析的要求，能够满足检测工作的要求，可以对甾烯醇进行测定。