纤维微菌C6对水中Cr(Ⅵ)去除条件优化及机理研究

高婧琪， 张 杰， 蹇庭昆， 夏 越， 杜闻峥， 严 馨， 冯 甦

(四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室， 成都 610064)

1 引 言

近几十年来，人类开展了各种工业生产活动，如钢铁生产、冶炼、电镀、印刷、印染、造纸、纺织、化肥和农药制造等[1-2]，这些工业活动造成了环境中的重金属污染.在中国，潜在毒性元素污染了2000万公顷的耕地，约占耕地总面积的20%，其中铬(Cr)污染地区占毒性元素污染总面积的5.1%，中国的Cr污染土壤超过总面积的1.1%[3].环境中Cr主要以两种不同的氧化态存在，六价Cr(Ⅵ)和三价Cr (Ⅲ)[4-5]，其中Cr(Ⅵ)的毒性更大，Cr(Ⅵ)是八种对人体最有害的化学物质之一，也是国际上公认最具致癌性的金属之一[6-7].长时间的暴露在Cr(Ⅵ)环境中会对人体产生危害，损害皮肤，眼睛，血液，呼吸道和免疫系统[8-9].Cr(Ⅵ)可以显著减少神经元细胞的数量，表现出神经毒性[10].在细胞水平上，Cr(Ⅵ)的遗传毒性作用会导致氧化应激、DNA损伤和肿瘤发展的损害[11-12].

从水体中去除Cr(Ⅵ)的传统方法包括物理化学方法，例如化学沉淀、膜技术、离子交换、电化学处理等[13].这些方法对于高含量Cr(Ⅵ)的去除有一定的效果，但是这些方法效率较低，价格昂贵且有容易造成二次污染的风险[14].为了克服这些问题，生物吸附可以作为一种有效的替代方法，其中微生物吸附技术主要利用微生物的新陈代谢对重金属进行去除，其经济性与去除效率较高，且生态友好、具有可持续性，因此被认为是一项很有前景的重金属修复技术[15-16].

本实验以成都市双流区某皮革厂附近受污染的土壤作为分离对象，分离得到的一株高效除Cr(Ⅵ)细菌——纤维微菌C6.用响应面法(response surface methodology，RSM)优化该菌株去除污染废水中Cr(Ⅵ)的条件.首先通过单因素实验得到各影响因子的最佳实验值，探究pH、温度、反应时间和Cr(Ⅵ)初始浓度四个因素及其交互作用对吸附作用的影响，建立Box-Behnken中心组合设计响应面优化模型对高效除Cr(Ⅵ)细菌的去除条件进行优化，确定最佳吸附条件.同时通过扫描电子显微镜(SEM)和傅里叶红外吸收光谱(FTIR)对吸附Cr(Ⅵ)前后菌体表面结构和官能团的变化进行探究，对菌体去除Cr(Ⅵ)的机理进行初步探讨.本研究有助于为Cr(Ⅵ)污染的修复提供新的微生物吸附材料.

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 菌种 成都市双流区某皮革厂附近污染土壤分离得到的高效除Cr(Ⅵ)细菌，该菌株具有在水体中吸附Cr(Ⅵ)的能力.

2.1.2 试剂 胰蛋白胨，氯化钠，酵母提取物，甘油，重铬酸钾，硫酸，磷酸，丙酮，二苯碳酰二肼，细菌DNA提取试剂盒，细菌16S rRNA基因通用引物F27/R1492(华大基因生物公司)，戊二醛，乙醇.

2.1.3 主要溶液及试剂配制 LB培养基：称取胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，酵母提取物5 g，加入超纯水至1 000 mL，加热搅拌使之充分溶解，将培养基pH值调至7.3 ± 0.2之间.蓝口瓶分装，于121 ℃下，高压蒸汽灭菌20 min.LB固体培养基加入15～20 g琼脂，灭菌冷却后倒平板.

Cr(Ⅵ)标准溶液：称取2.829 g在120 ℃干燥2 h至恒重的重铬酸钾(K2Cr2O7)，用水溶解后移入1 000 mL容量瓶，用去离子水稀释至标线并摇匀，配置成每毫升含1 mg的Cr(Ⅵ)标准溶液.

二苯碳酰二肼溶液：称取0.2 g二苯碳酰二肼溶于50 mL丙酮中，加水稀释至100 mL摇匀，储存于棕色瓶中，置于4 ℃冰箱保存备用.

2.1.4 仪器 恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，UV-2450分光光度计(岛津)，PHS-25 pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)，SKY-111B摇床(上海苏坤有限公司)，AFZ-1002-U艾科浦超纯水系统(艾科浦公司)，立式高压灭菌锅(上海申安公司).

2.2 方 法

2.2.1 菌株分离 称取污染土壤样品10 g，放入装有90 mL无菌水的150 mL锥形瓶中，取震荡后的样品溶液用无菌水依次稀释，取稀释的样品溶液涂布于含有初始Cr(Ⅵ)浓度为50 mg/L的LB固体培养基上，倒置培养.挑取形态不同的单菌落平板划线，并逐步升高LB固体培养基中Cr(Ⅵ)浓度，反复划线纯化，直至得到多株单一菌落.将纯化之后的单一菌落写好编号，于4 ℃条件下保存备用.

2.2.2 Cr(Ⅵ)标准曲线制作 依次移取Cr(Ⅵ)标准液0.0、 0.25、 0.50、 1.00、 2.00、 3.00、 4.00 mL于25 mL比色管中，用蒸馏水稀释至12.5 mL标线.向以上溶液分别加入硫酸(1+1)溶液0.5 mL和磷酸(1+1)溶液0.5 mL，加入显色剂二苯碳酰二肼溶液2 mL，用蒸馏水稀释至25 mL标线，摇匀，放置10 min左右.在540 nm波长处以空白试剂作为参比测定吸光度.以吸光度为纵坐标，相应Cr(Ⅵ)含量为横坐标，绘制Cr(Ⅵ)标准曲线.

2.2.3 高效除Cr(Ⅵ)菌株筛选 将筛选出的多株高效耐Cr(Ⅵ)菌株分别无菌接种至LB液体培养基中，振荡培养16 h作为种子液.向100 mL锥形瓶中加入含Cr(Ⅵ)浓度为50 mg/L的LB液体培养基27 mL，将菌液调节至OD600为1.5，按10%的接种量加入到容量为100 mL锥形瓶中使总体积为30 mL.培养24 h，取培养液离心，再分别取上清液，用二苯碳酰二肼分光光度法测OD540，测定Cr(Ⅵ)含量，并计算Cr(Ⅵ)的去除率，去除率计算见公式：

Cr(Ⅵ)去除率(%)=(C0-Ce)/C0×100%

其中C0为初始Cr(Ⅵ)浓度，Ce为吸附后上清液中Cr(Ⅵ)含量.

比较各培养基中细菌对Cr(Ⅵ)的去除率，筛选出高效除Cr(Ⅵ)菌株.对菌株提取DNA，进行PCR扩增并对扩增产物测序鉴定，测序结果在NCBI网站上的GeneBank数据库内的进行相似性分析，初步判定菌株的种属，并在MAGE软件中构建系统发育树.

2.2.4 单因素实验 研究了四个因素对菌体去除Cr(Ⅵ)效率的影响，包括溶液pH(4～11)、温度(15～40℃)、接触时间(0.5～5 d)、Cr(Ⅵ)初始浓度(20～120 mg/L).取上述在150 r/min摇床上培养一段时间Cr(Ⅵ)和菌体混合液，在4 ℃，8 000 r/min条件下离心5 min，分别取上清液0.5 mL，用二苯碳酰二肼分光光度法测OD540，并计算Cr(Ⅵ)的含量和去除率，所有实验设置三组平行实验.

2.2.5 响应面设计 采用Design-Expert软件进行响应面优化Box-Behnken实验设计，分析了溶液pH、温度、反应时间、Cr(Ⅵ)初始浓度这四个因素相互作用对菌体去除Cr(Ⅵ)效率的影响.响应面变量因素和水平设计分别为溶液pH(6、7、8)，温度(25、 30、 35 ℃)，反应时间(1、 2、 3 d)，Cr(Ⅵ)初始浓度(40、 60、 80 mg/L).

2.2.6 扫描电子显微镜(SEM)分析 使用扫描电子显微镜探究纤维微菌C6去除Cr(Ⅵ)前后菌体变化，将吸附前后的菌体用PBS缓冲液冲洗3次，每次20 min，加入3%戊二醛放入4 ℃冰箱固定24 h，8 000 r/min离心5 min，用PBS缓冲液冲洗3次，然后进行乙醇梯度脱水，分别脱水20 min；将处理好的样品冷冻干燥1 h，喷金上机观察.

2.2.7 傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析 将吸附前后的菌体在8 000 r/min下分别离心5 min，将菌体沉淀在-40 ℃冰箱预冻4 h，再将其转移至冷冻干燥器中冻干至固体粉末.在样品中加入KBr，充分混匀研细后压片，放置于傅里叶红外吸收光谱仪上，进行红外光谱的检测.

3 结果与分析

3.1 菌株筛选及其鉴定

如图1所示Cr(Ⅵ)标准曲线线性关系为y=0.6282x-0.0012且R2=0.9994，具有较高的相关性，可用于后续实验Cr(Ⅵ)含量的检测.将初步筛选得到6株耐Cr(Ⅵ)菌进行研究，发现编号为C6的菌株对Cr(Ⅵ)去除效率最高，达到58.13%.对该菌株进行测序，如图2所示，经过NCBI数据库比对和系统发育树的结果显示，C6属于纤维微菌属，故将其命名为纤维微菌C6，纤维微菌属是一种放线菌，其特点是具有分解木质纤维素的能力[17]，选取该菌株作为本研究所需菌株开展后续实验.

图1 Cr(Ⅵ)含量测定标准曲线Fig.1 Standard curve for Cr(Ⅵ)

3.2 单因素试验结果与分析

3.2.1 接触时间对纤维微菌C6去除Cr(Ⅵ)的影响 为了研究不同接触时间下纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)去除的影响，设置接触时间分别为0.5、1、1.5、2、3、4、5 d，其他反应条件选取如下：pH=7，温度 35 ℃，Cr(Ⅵ)初始浓度为20 mg/L.如图3所示，随着接触时间的增加，纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)去除的过程主要分为两个阶段：第一阶段在0～2 d内，去除效率增加趋势明显，2～5 d去除效率达到平衡状态，在第2 d达到最大去除效率92.27%，因此采用接触时间2 d用于后续实验.

图2 C6菌株系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of C6 strain

3.2.2 pH对纤维微菌C6去除Cr(Ⅵ)的影响 为了研究不同pH下纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)去除的影响，设置pH分别为4、5、6、7、8、9、10、11， 其他反应条件选取如下：温度 35 ℃，Cr(Ⅵ)初始浓度为20 mg/L，接触时间2 d.如图4所示，在pH 4～7，随着pH增大，纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)的去除效率增加；在pH 7～11随着pH增大 Cr(Ⅵ)的去除效率逐渐减小，在pH为7时达到最适去除条件，去除效率为92.23%，因此采用pH为7用于后续实验.

3.2.3 温度对纤维微菌C6去除Cr(Ⅵ)的影响 为了研究不同温度下纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)去除的影响，设置温度分别为15、20、25、30、35、40 ℃，其他反应条件选取如下：pH 7，Cr(Ⅵ)初始浓度为20 mg/L，接触时间2 d.如图5所示，在15～30 ℃，随着温度的增加，Cr(Ⅵ)的去除效率增加，在30 ℃达到最适去除温度，最高去除效率达到93.89%，在30～40 ℃去除效率基本处于平衡状态，采用温度30 ℃用于后续实验.

图4 pH对Cr(Ⅵ)去除效率的影响Fig.4 Effect of pH Cr(Ⅵ) removal efficiency

图5 温度对Cr(Ⅵ)去除效率的影响

3.2.4 Cr(Ⅵ)初始浓度对纤维微菌C6去除Cr(Ⅵ)的影响 为了研究不同Cr(Ⅵ)初始浓度下纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)去除的影响，设置Cr(Ⅵ)初始浓度分别为20、40、60、80、100、120 mg/L.其他反应条件选取如下：pH 7，接触时间2 d，温度30 ℃.如图6所示，在初始浓度为20～60 mg/L时，随着Cr(Ⅵ)初始浓度的增加，Cr(Ⅵ)的去除效率增加，在60 mg/L达到最适去除初始浓度，去除效率为94.77%；在60～120 mg/L范围内，随着Cr(Ⅵ)初始浓度的增加，Cr(Ⅵ)的去除效率先下降后逐渐达到平衡状态.

图6 Cr(Ⅵ)初始浓度对Cr(Ⅵ)去除效率的影响

3.3 响应面试验结果与分析

本研究在单因素实验的基础上，选取4个显著的影响因素作为对象，利用Design-Expert软件对纤维微菌C6设计了29组4独立因素Box-Behnken响应面实验，如表1所示.运用Design-Expert8.0.5.0软件，通过对实验数据进行多元回归分析，得到二元回归方程式为:

Y=+74.86-0.48A+4.18B+3.25C-

1.64D+3.49AB+0.70AC-4.02AD+

3.92BC-4.39BD+1.36CD+0.29A2+

3.83B2-5.22C2+3.19D2

表1 纤维微菌C6去除率响应面实验设计及结果

表2以纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)的去除率作为响应值对响应面结果进行方差分析，由表可知模型P值为0.004 2<0.050 0，回归显著，表明拟合的二次多项回归模型具有统计学意义有良好的预测能力.回归模型的相关系数R2=0.82表明该模型的拟合程度较好，回归模型失拟项P值为0.2348>0.05，失拟不显著，表明模型没有异常数据，能很好地进行预测.

表2 二元回归方程的方差分析

残差分析可以进一步检验回归模型的正确性.若残差分布图中的数据点呈现线性趋势分布，则表示残差服从正态分布.残差的正态概率图如图7a所示，残差数据点在直线两侧分布均匀，表明残差服从正态分布，即回归模型准确.空间中某一点的所有参数对响应的影响可以根据图7b所示的摄动图进行评估.温度(B)和接触时间(C)的陡坡表明Cr(Ⅵ)去除率的响应对此因素很敏感.pH(A)接近平坦曲线对Cr(Ⅵ)去除率的敏感性较低.因此温度和接触时间是影响Cr(Ⅵ)去除率的关键因素.

图7 纤维微菌C6去除Cr (VI)的残差正态概率和扰动

根据响应面结果绘制出响应面曲线等高图如图8所示，图8a显示了温度和溶液pH对Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用.当温度在30 ℃以下，溶液pH 5～7时，纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)去除率较高；在32～40 ℃、溶液pH 7～9的范围内Cr(Ⅵ)去除率随着温度和溶液pH的增加而增加.图8b显示了接触时间和溶液pH对Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用，如图8b所示，在溶液pH 5～9时，Cr(Ⅵ)去除率随着接触时间的增加而增大.在pH为7，接触时间为2 d时达到最佳去除效率.图8c显示了Cr(Ⅵ)初始浓度和溶液pH对Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用，当溶液pH 7～9时，Cr(Ⅵ)初始浓度为40～50 mg/L时或当溶液pH 5～7时，Cr(Ⅵ)初始浓度为65～80 mg/L时，纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)去除率随着Cr(Ⅵ)初始浓度的增加而增大.图8d显示了温度和接触时间对Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用，如图8d显示，在30～40 ℃的范围内，随着接触时间的增加，纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)去除率也在增加.图8e显示了温度和Cr(Ⅵ)初始浓度对Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用，在30～40 ℃的范围内，随着Cr(Ⅵ)初始浓度的增加，纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)去除率在减少.图8f显示了接触时间和Cr(Ⅵ)初始浓度对Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用，在Cr(Ⅵ)初始浓度40～60 mg/L时，随着接触时间的增加和Cr(Ⅵ)初始浓度的减小，纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)去除率增加.

在最佳吸附条件下，即pH为7.85，温度34.07 ℃，接触时间2.88 d，初始Cr(Ⅵ)浓度40.08 mg/L，纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)的去除率达到最高为95.75%.

3.4 纤维微菌C6去除Cr(Ⅵ)前后SEM分析

如图9a所示，在没有Cr(Ⅵ)处理的条件下，纤维微菌C6菌体细胞呈短杆状，表面清晰光滑且分散.如图9b所示，Cr(Ⅵ)处理过的菌体表面不规则，有颗粒状沉淀，并且菌体细胞排列在一起形成粘连的结构.这种由Cr(Ⅵ)胁迫引起的菌株形态变化可能在细菌防御外部Cr(Ⅵ)毒性和Cr(Ⅵ)在细菌细胞表面的吸附机制中起关键作用.细菌表面吸附的Cr会引起细菌表面形态的变化.相同的情况也在Karthik等人[18]的研究结果中出现.

3.5 纤维微菌C6去除Cr(Ⅵ)前后FTIR分析

为了研究Cr(Ⅵ)与纤维微菌C6相互作用中可能涉及的官能团，对纤维微菌C6菌体与Cr(Ⅵ)反应前后进行了红外光谱分析.如图10所示，在3 274 cm-1观察到的波段对应于O-H拉伸振动[18]，与Cr(Ⅵ)反应后的红外光谱图O-H拉伸移至较高的频率3 417 cm-1.在1 680～1 630 cm-1、1 545～1 530 cm-1处的改变与酰胺I的C=O拉伸和酰胺II的N-H的拉伸振动有关[19]，此处反应前分别为1 635和1 540，反应后的特征峰发生漂移变为1 646和1 546 cm-1.胺分子中的C-N键伸缩振动区为1 360～1 020cm-1，此范围内吸收峰由1 216和1 072 cm-1分别变为了1 238和1 078 cm-1.从以上结果可以看出，羧基、酰胺Ⅰ(C=O键)、酰胺Ⅱ(N-H键)、C-N键可能参与了生物吸附过程.

图9 纤维微菌C6吸附Cr(Ⅵ)前后的SEM分析 (a)吸附前;(b)吸附后.Fig.9 SEM images of Cellulosimicrobium sp. strain C6 (a) Before adsorption; (b) after adsorption.

图10 纤维微菌C6吸附Cr(Ⅵ)前后傅里叶红外光谱分析 Fig 10 FTIR analysis before and after removal Cr(Ⅵ) by Cellulosimicrobium sp. strain C6

4 讨 论

随着重金属污染问题日益严重，新型的微生物修复技术有着越来越重要的地位，微生物修复技术具有以下优点：修复效果较理想、操作简便、成本低廉、环境友好等[16].本研究对成都市双流区某皮革厂附近污染土壤进行分离和纯化，得到一株菌株：纤维微菌C6.单因素实验结果表明，纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)具有较高的去除能力.响应面法是一种可靠的、功能强大的生物吸附过程中建模和优化工具[20].根据单因素试验的结果，基于Box-Behnken设计的响应面法通过纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)去除条件的优化，建立了响应与自变量之间的关系.结果表明，实验模型与实验数据拟合良好，同时温度和接触时间是影响生物吸附过程中最重要的参数.扫描电镜表明，细菌表面有颗粒状沉淀，可能是通过吸附作用达到对Cr(Ⅵ)的去除效果.红外光谱也证明了与Cr(Ⅵ)反应后，细胞表面的羧基、酰胺Ⅰ(C=O键)、酰胺Ⅱ (N-H键)、C-N键可能参与了生物吸附过程.Karthik等人[18]也对纤维微菌属的菌株去除Cr(Ⅵ)的机理进行过讨论，溶液中Cr(Ⅵ)通过与细胞表面官能团的配位而被吸附在细胞表面，形成颗粒状沉淀，再通过转运蛋白的转运进入细胞内部，进行细胞内部的积累.此前尹华等[21]研究表明红螺菌R-04对Cr(Ⅵ)吸附率为84%，根霉菌对Cr(Ⅵ)吸附率为60%～80%，而本研究中纤维微菌C6对Cr(Ⅵ)的去除效率高达95.75%，表明纤维微菌C6具有优异的Cr(Ⅵ)去除性能，在去除水体重金属污染中具有较大的优势.现在已经有相关研究对去除污染物的微生物进行固定化处理从而制备成具有高效去除能力的固定化生物吸附剂，该技术有利于将游离的微生物菌体固定起来达到对水体中重金属的去除[22]，本研究中筛选的菌株也具有进一步开发和应用的价值.