左旋含羞草碱通过调控LATS1表达对结直肠癌细胞增殖及凋亡的影响

李永慧 王倩林 贾笑强 刘明成

(西宁市第一医疗集团总院消化内科, 青海 西宁 810000)

结直肠癌是消化道中常见的恶性肿瘤之一，其早期难以发现导致发病率和死亡率较高[1-4]。研究表明药物治疗在结直肠癌治疗中发挥着重要作用，临床上中药常用于放化疗及手术辅助治疗结肠癌患者，不仅可以增强化疗效果，还可减轻化疗的毒副反应，降低结直肠癌复发及转移，对提高患者生存质量具有较好疗效[5-7]。因此，开发新的抗结直肠癌药物对其临床治疗具有重要意义。左旋含羞草碱是从豆科含羞草属植物中提取的植物氨基酸，研究报道左旋含羞草碱可以有效抑制骨肉瘤细胞增殖并诱导骨肉瘤细胞凋亡[8]，还可抑制头颈鳞状细胞癌细胞增殖并诱导其凋亡[9]。然而左旋含羞草碱对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制尚不清楚。大肿瘤抑制基因1(large tumor suppressor gene 1，LATS1)是Hippo信号通路中的重要激酶的关键组分之一，其具有抑制肿瘤发生和发展的作用[10]。研究报道结直肠癌组织中LATS1 mRNA低表达，抑制LATS1的表达可促进结肠癌细胞的增殖，侵袭和迁移[11]。此外，LATS1在食管鳞癌组织中也低表达，过表达LATS1可抑制细胞增殖、迁移和侵袭，同时能够促进细胞凋亡[12]。研究报道虫草素可上调LATS1表达，通过激活Hippo信号通路抑制宫颈癌细胞增殖，促进凋亡[13]。因此，本实验旨在研究左旋含羞草碱是否通过调控LATS1影响结直肠癌细胞的增殖、凋亡。

1 材料与方法

1.1 材料 结直肠癌细胞株SW480(上海远慕生物科技有限公司)，RPMI-1640培养基(武汉益普生物科技有限公司)，左旋含羞草碱(上海甄准生物科技有限公司)，MTT试剂盒(美国sciencell公司)，RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸(BCA)试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(江西江蓝纯生物试剂有限公司)，实时荧光定量PCR试剂盒(北京拜尔迪生物技术有限公司)。

1.2 细胞处理与分组 结直肠癌细胞SW480用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，取对数生长期细胞SW480，分别用终浓度为100、200、400 μM的左旋含羞草碱处理，记为左旋含羞草碱低、中、高浓度组，正常培养的细胞作为对照组；将pcDNA、pcDNA-LATS1转染至SW480细胞中，记为pcDNA组、pcDNA-LATS1组；将si-NC、si-LATS1转染至SW480细胞后用400 μM的左旋含羞草碱处理，记为左旋含羞草碱+si-NC组、左旋含羞草碱+si-LATS1组。

1.3 MTT检测细胞增殖抑制率 收集各组细胞，按试剂盒说明操作，用酶标仪检测490 nm吸光度(OD)值。细胞增殖抑制率(%)=(1-OD实验组值/OD空白对照组值)×100%。

1.4 蛋白质印迹(Western blot)法检测CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、LATS1蛋白表达水平 提取细胞总蛋白，对蛋白样品定量，然后进行电泳，接着转至PVDF膜，封闭后加入一抗，在4 ℃条件下孵育过夜，然后加入二抗孵育2 h，再用ECL发光液显影，成像后检测蛋白条带灰度值，以目的条带和GAPDH的比值作为相对表达水平。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，漂洗后按试剂盒说明操作，然后上流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。

1.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测LATS1 mRNA的表达水平 提取各组细胞总RNA，合成cDNA，按照试剂盒说明进行PCR，相对表达量用2-ΔΔCt法计算。LATS1以GAPDH为内参，LATS1上游引物序列：5′-GAAACAAATTCTTCTCGGAGTACT TC-3′，下游引物序列：5′-CTTCTGTTGTTAGTTTT CTGAAGAGC-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGT TGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游引物序列：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。

2 结果

2.1 左旋含羞草碱对结直肠癌SW480细胞增殖的影响 与对照组比较，左旋含羞草碱-低、中、高浓度组SW480细胞增殖抑制率升高，SW480细胞中CyclinD1的表达水平降低，p21表达水平升高，且呈浓度依赖性(P<0.05)，见图1、表1。

图1 增殖相关蛋白表达

表1 左旋含羞草碱对结直肠癌SW480细胞增殖的影响

2.2 左旋含羞草碱对结直肠癌SW480细胞凋亡的影响 与对照组比较，左旋含羞草碱低、中、高浓度组SW480细胞凋亡率升高，SW480细胞中Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高，且呈浓度依赖性(P<0.05)，见图2、表2。

表2 左旋含羞草碱对结直肠癌SW480细胞凋亡的影响

图2 左旋含羞草碱对结直肠癌SW480细胞凋亡的影响

2.3 左旋含羞草碱对结直肠癌SW480细胞中LATS1表达的影响 与对照组比较，左旋含羞草碱-低、中、高浓度组SW480细胞中LATS1 mRNA和蛋白表达水平升高，且呈浓度依赖性(P<0.05)，见图3、表3。

图3 LAST1蛋白表达

表3 左旋含羞草碱对结直肠癌SW480细胞中LATS1表达的影响

2.4 LATS1过表达对结直肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响 与pcDNA组比较，pcDNA-LATS1组SW480细胞中LATS1表达水平升高，SW480细胞增殖抑制率升高，SW480细胞凋亡率升高，SW480细胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的相对表达水平降低，p21、Bax蛋白的相对表达水平升高(P<0.05)，见图4、表4。

表4 LATS1过表达对结直肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响

图4 LATS1和增殖、凋亡相关蛋白表达

2.5 抑制LATS1表达逆转了左旋含羞草碱(400 μM)对结直肠癌SW480细胞增殖和凋亡的作用与左旋含羞草碱+si-NC组比较，左旋含羞草碱+si-LATS1组SW480细胞中LATS1表达水平降低，SW480细胞增殖抑制率降低，SW480细胞凋亡率降低，SW480细胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的相对表达水平升高，而p21、Bax蛋白的相对表达水平降低(P<0.05)，见图5、表5。

表5 抑制LATS1表达逆转了左旋含羞草碱对结直肠癌SW480细胞增殖和凋亡的作用

图5 LATS1和增殖、凋亡相关蛋白表达

3 讨论

结直肠癌是发病率和病死率较高的恶性肿瘤，中医药治疗在结直肠癌综合治疗中占有重要地位，从中药中寻找预防和治疗结直肠癌的有效成分，并研究其作用机制成为当前结直肠癌研究的热点[14-17]。研究报道番茄碱能通过抑制HCT116细胞的增殖与转移，促进细胞凋亡[18]。苦参碱抑制结直肠癌细胞增殖和侵袭，并增加细胞凋亡[19]。研究发现左旋含羞草碱可抑制PC-3和LNCaP前列腺癌细胞的增殖[20]，且左旋含羞草碱可诱导caspase-9介导的骨肉瘤细胞凋亡，从而抑制细胞增殖[21]。为研究左旋含羞草碱对结直肠癌细胞的影响，本实验用不同浓度的左旋含羞草碱处理结直肠癌细胞SW480，结果显示，SW480细胞增殖抑制率升高，SW480细胞凋亡率升高，且呈浓度依赖性。表明左旋含羞草碱可剂量依赖的抑制结直肠癌细胞SW480增殖、促进细胞凋亡。

研究报道LATS1在宫颈癌组织中下调表达，过表达LAST1可抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭[22]。LATS1可通过下调Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)的表达水平促进A549细胞的凋亡，诱导G1期阻滞，降低细胞的增殖能力[23]。LMO3通过直接与LATS1相互作用并抑制Hippo信号传导来促进肝细胞癌的侵袭、转移[24]。本实验结果显示，过表达LATS1后，SW480细胞的增殖抑制率和凋亡率升高，表明过表达LATS1可抑制结直肠癌细胞增殖，并促进细胞凋亡。本实验还发现左旋含羞草碱可提高LATS1的表达水平，而抑制LATS1表达逆转了左旋含羞草碱对结直肠癌SW480细胞增殖和凋亡的作用。

4 结论

本研究结果显示，左旋含羞草碱可通过上调LATS1表达抑制结直肠癌细胞增殖，并促进细胞凋亡。