基于NLRP3炎症小体信号通路探讨盐酸小檗碱对三叉神经痛大鼠的影响Δ

梁自飞，吴安石，沈文振，魏昌伟#

(1.北京朝阳急诊抢救中心麻醉科，北京 100020； 2.首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉科，北京 100020)

三叉神经痛(trigeminal neuralgia，TN)是指机体三叉神经分布区域由于受到某些触觉刺激，如说话、洗脸及刷牙等，引发的剧烈疼痛，有时会附带面部的痛性痉挛，中老年女性易患该病[1]。TN易发生于面部右侧，可对患者身体健康造成严重影响，亦会影响患者的精神生活[2]。一般情况下，机体为维持局部生理平衡，末梢神经中包含着各种非神经细胞，当神经受到损伤时，这些细胞会释放白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎症因子，引起神经组织产生相关递质，在痛觉传递神经处产生作用，使痛阈降低，产生疼痛[3]。NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体为胞内模式识别受体，可激发调节免疫及炎症反应，由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和胱天蛋白酶1(caspase-1)组成通路，对各种炎症反应具有一定调节作用[4]。降钙素基因相关肽(CGRP)在血管扩张和痛觉传导中有重要作用，近年来研究结果表明，CGRP与TN的发生密切相关[5-6]。盐酸小檗碱是从中药黄连中分离而来，为黄连的主要有效成分，具有抗菌、抗肿瘤、抗肺结核以及消炎等功效[7]。但是，其对TN的治疗作用尚不明确。本研究通过制备TN模型大鼠，分析盐酸小檗碱对TN模型大鼠的作用及对NLRP3炎症小体信号通路的影响，以期为明确其具体机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器：Electric Von Frey型电子测痛仪(天津仪数科技有限公司)；ELx800型酶标仪(美国Bio-Tek公司)；TL988型qRT-PCR仪(西安天隆科技有限公司)；Gel Doc XR+型蛋白凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

1.1.2 药品与试剂：盐酸小檗碱(原料药，纯度98.5%，长沙祯祥生物科技有限公司，批号为633-65-8)；IL-1β酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA)试剂盒、TNF-α ELISA试剂盒(美国Sigma公司，批号为RAB3219、RAB0328)；RNA抽提试剂盒(北京天根生化科技有限公司，批号为DP419)；逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司，批号为RRO37 A)；实时荧光定量聚合酶链式反应(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)试剂盒(美国Genecopoeia公司，批号为QP115)；蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司，批号分别为C510003、C503021)；兔抗鼠CGRP、NLRP3、ASC、caspase-1及β-肌动蛋白(β-actin)一抗(英国Abcam公司，批号分别为ab5419、ab3520、ab3518、abB3517及ab3508)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、羊抗鼠IgG二抗(上海生工生物工程有限公司，批号分别为F619537、D110098)。

1.1.3 动物：SPF清洁级雄性SD大鼠75只，周龄8～9周，体重220～250 g，购于浙江中医药大学动物实验中心，动物生产许可证号为SCXK(浙)2019-0012，动物使用许可证号为SYXK(浙)2019-0031，动物质量合格证号为191103057。

1.2 方法

1.2.1 动物建模、分组及给药：实验前l周，使用电子测痛仪适应性刺激大鼠三叉神经支配区域，使大鼠适应后痛阈>26，每日连续5次。随机取15只大鼠设为假手术组，剩下60只大鼠均采用眶下神经缩窄术(ION-CCI)[8]制备TN大鼠模型，即腹腔注射水合氯醛(3 ml/kg)100 g/L麻醉，剔除大鼠右侧面部全部毛发并用酒精消毒，于大鼠眶下缘3～4 mm处，紧贴鼻根，沿鼻骨方向长约3～5 mm处切口，分离出2条眶下神经(相隔约1 mm)，使用4-0烙制羊肠线结扎(假手术组仅分离眶下神经，不结扎，其于操作步骤与上述相同)。将建模成功的大鼠随机分为模型组、盐酸小檗碱低剂量组、盐酸小檗碱中剂量组及盐酸小檗碱高剂量组，每组15只。盐酸小檗碱低、中及高剂量组大鼠分别予以盐酸小檗碱溶液25、50及100 mg/kg灌胃[9]，假手术组和模型组大鼠则分别予以等量0.9%氯化钠溶液灌胃，灌胃体积10 ml/kg，1日1次，共给药14 d。手术过程中，所用物品均高压灭菌，术后常规饲养。

1.2.2 机械痛阈值的测定：各组大鼠分别在建模前3 d、建模前1 d行机械刺激适应，建模成功后1 d开始，每间隔1 d用电子测痛仪刺激眶下神经分布区域[10]。每只大鼠刺激6次，每次间隔1 min。当大鼠出现以下任何一种行为学变化时记为阳性反应，①退缩反应，受刺激后动物表现为快速后退；②搔脸行为，连续搔抓面部刺激区域；③攻击行为，大鼠快速抓挠刺激物做出攻击动作。观察电子测痛仪数值，记录使大鼠产生阳性反应的强度最小值，即为术侧机械痛阈值。

1.2.3 大鼠术侧三叉神经节组织获取：术后第15日，应激实验完成后，各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(3 ml/kg)100 g/L麻醉，实施安乐死，分离并收集大鼠术侧三叉神经节组织，平均分为3份并置于-80 ℃保存，分别用于后续ELISA、qRT-PCR和蛋白质免疫印迹(western blot，WB)实验研究。

1.2.4 ELISA法分别测定术侧三叉神经节组织中IL-1β、TNF-α含量：从“1.2.3”项中的-80 ℃冰箱取出1份术侧三叉神经节组织，冰上融化，用0 ℃、0.9%氯化钠溶液制成5%匀浆后，于4 ℃、1 200 r/min下离心15 min，取上清液。具体操作步骤按ELISA试剂盒说明书进行操作，测量样本490 nm处光密度值，根据标准曲线计算各组大鼠三叉神经节组织中IL-1β、TNF-α含量。

1.2.5 qRT-PCR法检测术侧三叉神经节组织中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA表达情况：从“1.2.3”项中的-80 ℃冰箱取出1份术侧三叉神经节组织，冰上融化，采用RNA抽提试剂盒提取各组大鼠神经节组织总RNA，用逆转录试剂盒得到cDNA，以cDNA为模板，按照qRT-PCR试剂盒说明书配置PCR反应体系，即2×SYBR mix 10 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl，10×cDNA模板1 μl。反应条件设定为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火50 s，40个循环，72 ℃延伸10 min。分别以GAPDH作为内参，根据2-ΔΔCt算法计算mRNA表达水平。CGRP、NLRP3、ASC、caspase-1及GAPDH引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 qRT-PCR primer sequence

1.2.6 WB法检测术侧三叉神经节组织中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白表达情况：从“1.2.3”项中的-80 ℃冰箱取出1份大鼠术侧三叉神经节组织，提取总蛋白并对蛋白进行定量。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转PVDF膜，4 ℃下添加一抗CGRP、NLRP3、ASC、caspase-1和β-actin抗体(均为1∶500)，孵育过夜。洗涤后添加羊抗鼠IgG二抗(稀释比1∶5 000)常温孵育2 h。以β-actin为内参，采用Tanon 600图像分析系统分析CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠建模前后机械痛阈值比较

建模前3 d，各组大鼠机械痛阈值比较，差异无统计学意义(P>0.05)；建模后1、3 d，与假手术组比较，模型组大鼠机械痛阈值降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而模型组和盐酸小檗碱低、中及高剂量组大鼠两两比较的差异无统计学意义(P>0.05)；建模后5～14 d，与假手术组比较，模型组大鼠机械痛阈值降低，与模型组比较，盐酸小檗碱低、中及高剂量组大鼠机械痛阈值依次升高，呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠建模前后机械痛阈值比较Tab 2 Comparison of mechanical pain threshold among four groups

2.2 盐酸小檗碱对大鼠三叉神经节组织中IL-1β和TNF-α含量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠三叉神经节组织中IL-1β、TNF-α含量明显升高；与模型组比较，盐酸小檗碱低、中及高剂量组大鼠三叉神经节组织中IL-1β、TNF-α含量依次降低，呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠三叉神经节组织中IL-1β、TNF-α含量比较Tab 3 Comparison of IL-1β and TNF-α in trigeminal ganglion tissues among four groups ng/L)

2.3 盐酸小檗碱对大鼠三叉神经节组织中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA、蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠三叉神经节组织中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA表达水平显著升高；与模型组比较，盐酸小檗碱低、中及高剂量组大鼠三叉神经节组织中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA表达水平依次降低，呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。与假手术组比较，模型组大鼠三叉神经节组织中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白表达水平显著升高；与模型组比较，盐酸小檗碱低、中及高剂量组大鼠三叉神经节组织中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白表达水平依次降低，呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5、图1。

表4 各组大鼠三叉神经节组织中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表达水平比较Tab 4 Comparison of expression levels of mRNA in CGRP, NLRP3, ASC, and caspase-1 in trigeminal ganglion tissues among four groups

表5 各组大鼠三叉神经节组织中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1的蛋白表达水平比较Tab 5 Comparison of expression levels of protein in CGRP, NLRP3, ASC and caspase-1 in the trigeminal ganglion tissues among four groups

A.假手术组；B.模型组；C.盐酸小檗碱低剂量组；D.盐酸小檗碱中剂量组；E.盐酸小檗碱高剂量组A. sham operation group; B. model group; C. low-dose group of berberine hydrochloride; D. medium-dose group of berberine hydrochloride; E. high-dose group of berberine hydrochloride图1 WB法检测各组大鼠三叉神经节组织中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1的蛋白表达情况Fig 1 Expression levels of protein in CGRP, NLRP3, ASC and caspase-1 in trigeminal ganglion tissues detected by WB

3 讨论

TN是神经病理性疼痛，局部节段性脱髓鞘改变为其主要病理特征[11]。CGRP是一种舒张血管的神经肽，对神经节间的痛觉传递起重要作用，在中枢神经、外周神经和感觉神经节内均有表达[12-14]。CGRP受体由3个部分组成，分别为降钙素受体样受体、受体活性修饰蛋白1和受体组分蛋白。研究结果表明，CGRP与TN、颜面部疼痛、痛觉过敏和偏头痛都有密切关系，但具体分子机制尚不清楚。本研究采用ION-CCI建立TN大鼠模型，该模型操作简单易行，能较好地模拟临床三叉神经受压迫引起的痛觉超敏现象，结果显示，建模前3 d和前1 d，各组大鼠机械痛阈值的差异无统计学意义(P>0.05)；而建模后5～14 d，与假手术组比较，模型组大鼠机械痛阈值显著降低，且建模后第15日，与假手术组比较，模型组大鼠三叉神经节组织中CGRP的mRNA、蛋白表达显著升高，与以往研究结果相符[15-16]，说明TN大鼠模型制备成功。给予盐酸小檗碱药物处理后，与模型组比较，盐酸小檗碱低、中及高剂量组大鼠机械痛阈值依次升高，三叉神经节组织中CGRP的mRNA、蛋白表达依次降低且呈剂量依赖性，提示盐酸小檗碱能降低三叉神经节组织CGRP的mRNA、蛋白表达量，减少神经节间的痛觉传递，增加TN大鼠机械痛阈值，在一定程度上保护大鼠免受TN带来的伤害。

张学智等[17]的研究结果发现，TN患者部分髓鞘受压迫后变薄，与一般的神经病变相似，可在三叉神经病变中产生炎症反应，进而引起神经胶质细胞浸润、轴索变性、雪旺细胞增生和炎症细胞浸润等。三叉神经节中炎症反应的关键转录因子核因子κB(NF-κB)可诱导NLRP3炎症小体信号通路的激活，该通路可进一步促使机体释放大量相关炎症因子[18]。本研究结果发现，与假手术组比较，模型组大鼠三叉神经节组织中IL-1β、TNF-α含量显著增高，提示NLRP3炎症小体信号通路控制的炎症因子IL-1β、TNF-α在TN发生发展中发挥了重要作用。NLRP3炎症小体是能够参与机体固有免疫，觉察体内微生物代谢物变化和应激反应，识别炎症刺激信号，调控炎症因子产生、释放的蛋白复合物[19]。张婷等[20]的研究结果发现，脊髓背角中IL-1β、TNF-α在神经病理痛大鼠模型中起传递痛觉的作用。马腾飞等[21]的研究结果发现，经眶下孔注射相关炎症因子IL-1β、TNF-α可制造大鼠TN模型。本研究发现，盐酸小檗碱处理的大鼠三叉神经节组织中IL-1β、TNF-α含量显著依次降低，呈剂量依赖性，提示盐酸小檗碱可减轻炎症反应。姜开洋等[22]的研究结果发现，IL-1β、TNF-α在气滞血瘀证原发性TN患者神经节内表达水平上调，与TN引起的炎症反应有关。本研究结果显示，模型组大鼠三叉神经节组织中NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA、蛋白表达水平均高于假手术组；与模型组比较，盐酸小檗碱低、中及高剂量组大鼠三叉神经节组织中NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA、蛋白表达水平依次减少，呈剂量依赖性，提示盐酸小檗碱可能通过抑制NLRP3炎症小体信号通路，减轻TN大鼠三叉神经节组织中炎症反应，从而缓解TN大鼠的症状。

综上所述，盐酸小檗碱可能通过抑制NLRP3炎症小体信号通路，降低TN大鼠机械痛阈值以及神经肽CGRP的表达，减轻炎症反应，从而减轻神经节间的痛觉传递，进而对TN大鼠起到一定的保护作用。