基于网络药理学的白术-白芍配伍治疗肠易激综合征的作用机制研究Δ

严海冬，缪文清，许巧欣，张志鹏，蔡延渠3,5,6#

(1.咸宁市中心医院/湖北科技学院第一附属医院胃肠外科二病区，湖北 咸宁 437000； 2.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006； 3.广东药科大学新药研发中心，广东 广州 510006； 4.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100； 5.广东省教育厅现代中药重点实验室，广东 广州 510006； 6.国家中医药管理局中药制剂实验室(三级)，广东 广州 510006)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)归属于非器质性肠道功能紊乱性疾病，分为腹痛型、便秘型、腹泻型和腹泻便秘交替型，临床常见伴有腹胀、腹痛、排便习惯和(或)大便性状改变等症状，可持续或间歇发作[1]。随着学习、工作和生活等压力的增加，IBS发病率也呈现出逐年升高的趋势[2]。但目前尚无治疗IBS的特效药，临床上多是采取对症进行治疗[3]。通过检索中国知网等数据库发现，在特色中医药理论指导下制定的方药在临床治疗IBS疾病方面具有较为显著的功效，常见的有宁肠汤[4]、白术芍药散[5]、四逆散[6]、葛根芩连汤[7]、附子理中汤[8]、补中益气汤[9]、柴术宁肠方[10]、风芍六君子汤[11]、疏肝健脾方[12]、升阳益胃汤[13]、肠乐胶囊[14]以及和胃化湿片[15]等。通过分析处方组成发现，白术-白芍配伍是中医临床治疗IBS腹痛、泄泻的常用药对，可起到补脾柔肝、扶土抑木之功效，在不同中药处方配伍中均具有十分重要的意义[16]。同时检索中国方剂数据库发现，含白术和白芍的方剂共有1 557首，在治疗腹痛腹泻、呕吐下痢及肝脾不和方面最为常见且疗效最佳[17]。由于目前尚无白术-白芍配伍用于IBS的具体研究，因此，有必要对白术-白芍药对的物质基础和作用机制进行更深入的探讨与分析。

网络药理学立足于生物整体系统，进行较为全面的网络分析，通过选取相关信号节点对多靶点药物进行分子设计，强调多途径调节信号通路，更能表现出中药方剂的多靶点、多作用显著特征，目前已尝试用于预测中药组方适用疾病和功效成分[18-19]。目前，在常用的数据库中，中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)已收录了500多种中药以及30 069多个中药化合物信息；中药综合数据库(traditional Chinese medicines integrated database，TCMID)收载了47 000个中药方剂、8 159种中药及25 210个中药化合物等信息；GeneCards数据库可提供基因及其与疾病间关系等多种信息；治疗靶点数据库(therapeutic target database，TTD)收载了3 101个已上市或临床研究阶段药物对应的靶标等信息；蛋白质序列数据库(UniProt)涵盖了Swissprot、TrEMBL及PIR等3大数据库信息，可分为UniProtKB、UniRef及UniParc 3大模块，拥有最丰富的蛋白质序列信息；String数据库收录了5 090个有机体及24 584 628种蛋白质信息，其交互包括直接(物理)关联和间接(功能)关联；Metascape(基因注释分析工具)汇聚了基因本体(gene ontology, GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)、UniProt和DrugBank等数据库资源数据，可进行生物过程和通路富集的注释、基因相关的蛋白质网络分析以及相关药物的分析[20]。基于以上数据库，本研究拟采用网络药理学分析技术筛选出白术-白芍药对中的潜在活性成分，同时对其作用靶点和作用机制进行预测，阐释白术-白芍配伍在治疗IBS中的物质基础和起效机制，为其在临床中的处方配伍应用提供相关的理论参考依据。

1 资料与方法

1.1 白术-白芍药对中相关活性成分及其对应基因靶点的筛选

在TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、TCMID数据库(http://www.megabionet.org/tcmid/)等数据库中检索中药“白术”“白芍”化学成分；根据ADME原理，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)体现了药物进入人体后通过吸收再分布到脏器，进而发生代谢及最后排泄的整体过程，类药性(drug likeness，DL)体现了成分与已知药物分子的相似性，故以OB≥30%、DL≥0.18为筛选调节，整理、分析和构建白术-白芍药对中关键活性成分的数据库。同时，进一步通过TCMSP数据库，逐一收集、统计关键活性成分的潜在蛋白靶点，再利用UniProt蛋白质序列数据库(https://www.uniprot.org/)校正靶点基因名。

1.2 IBS疾病靶点的收集

以“Irritable Bowel Syndrome”为关键词，通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、疾病相关的基因与突变位点数据库(a database of gene-disease associations，DisGeNET，http://www.disgenet.org/home/)和TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)进行检索，整理、分析和构建IBS疾病靶点数据库。

1.3 白术-白芍药对治疗IBS的靶点交集

借助Venny 2.1在线绘制平台(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)的分析功能，将白术-白芍药对作用靶点与IBS疾病靶点进行比对分析，选取交集靶点，整理、分析和构建白术-白芍药对治疗IBS靶点的数据库。

1.4 “药对-活性成分-作用靶点”网络构建

将白术-白芍药对、活性成分和交集靶点数据整理汇总，在Cytoscape 3.7.2软件中导入数据，进一步分析、构建和绘制“药对-活性成分-作用靶点”的网络关系图。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络的构建

整理交集靶点蛋白，将其以GENE SYMBOL格式上传至String数据库(https://string-db.org/)，进行PPI分析，物种参数设置为“Homo sapiens”，在软件Cytoscape 3.7.2中导入数据，进一步设置节点大小、颜色(反映连接度值Degree)，通过“Network analyze”功能对网络进行拓扑属性分析，根据Degree>中位数为条件筛选核心靶点。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

整理交集靶点，将其导入Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index.html)，参数条件：设置选择“OFFICE_GENE_SYMBOL”，物种限定为“Homo sapiens”，背景选择“Homo sapiens”，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以P≤0.01为条件筛选出白术-白芍药对治疗IBS的生物过程及其相关通路。

2 结果

2.1 白术-白芍药对的主要活性成分

通过数据库检索“白术”“白芍”，共获得140个活性成分，其中白术55个，白芍85个。以OB≥30%且DL≥0.18进一步筛选出活性较高成分20个，其中白术7个，白芍13个。白术-白芍药对的主要活性成分见表1(以OB由高至低进行排序)。

表1 白术-白芍药对中活性成分的筛选Tab 1 Screening of active components of drug pair of rhizoma atractylodes macrocephala and radix paeoniae alba

2.2 白术-白芍药对治疗IBS的主要潜在靶点

通过检索，“白术”“白芍”活性成分对应的作用靶点分别为18、88个，合并去重后为89个作用靶点。对疾病数据库以“Irritable bowel syndrome”为关键词进行检索，分别从DisGeNET、drugbank、GeneCards、OMIM和TTD数据库获得429、139、1 000、485和27个IBS的疾病治疗靶点，去重后获得1 774个靶点。经比对，白术-白芍药对作用靶点与IBS的疾病靶点存在55个交集靶点，主要有AKT1、白细胞介素(IL)6、TNF、PTGS2、JUN、CAT、CASP3及NOS3等，见图1。

图1 白术-白芍药对作用靶点与IBS疾病靶点的韦恩图Fig 1 Wayne diagram of target of drug pair of rhizoma atractylodes macrocephala and radix paeoniae alba and disease target of IBS

2.3 “药对-活性成分-作用靶点”网络

将白术-白芍药对、活性成分与交集靶点信息通过软件Cytoscape 3.7.2构建“药对-活性成分-作用靶点”网络，共包括个77节点和108条边，见图2。分析结果可知，山柰酚、β-谷甾醇、3β-乙酰氧基苍术酮、儿茶素、8β-乙氧基白术内酯Ⅲ、芍药苷及谷甾醇具有最高的度值，作用的靶点数目分别为62、37、16、12、6、5及4。推测其可能是发挥药效的主要活性成分。

图2 白术-白芍“药对-活性成分-作用靶点”网络Fig 2 “Drug pair-active components-effect target” network of drug pair of rhizoma atractylodes macrocephala and radix paeoniae alba

2.4 白术-白芍药对治疗IBS的关键靶点PPI网络

将交集靶点导入STRING数据库，获得相关信息后再通过Cytoscape 3.7.2软件绘制PPI网络。PPI网络中显示，节点55个，边376条，平均节点度值(Degree)为13.67；其中，Degree>20的靶点有13个，其Degree由高至低排序依次为AKT1、IL-6、TNF、PTGS2、JUN、CAT、CASP3、NOS3、ESR1、HMOX1、AHR、PPARG和ICAM1，见图3。

图3 白术-白芍药对关键靶点的蛋白质间相互作用的网络分析Fig 3 Network analysis of protein-protein interaction of key targets of drug pair of rhizoma atractylodes macrocephala and radix paeoniae alba

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

对共同交集靶点基因进行GO功能分析和 KEGG通路富集分析(P<0.01)。GO功能富集分析共获得47条生物功能显著富集，其中，生物过程(biological process，BP)涉及有毒物质、血液循环、有机环状化合物、细胞增殖、活性氧代谢和细胞对氮化合物的反应等；细胞成分(cell component，CC)涉及膜筏、突触前膜的组成成分、核包膜、细胞质核周区、受体复合体和血液微粒等；分子功能(molecular function，MF)涉及G蛋白偶联胺受体活性、蛋白同源二聚活性、血红素结合、核受体活性和铵离子结合等，见图4。KEGG通路富集分析中，主要涉及的信号通路有癌症途径、钙信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、雌激素信号通路、铂耐药性以及cGMP-PKG信号通路等，见图5。

图5 白术-白芍药对治疗IBS关键靶点的KEGG通路富集分析Fig 5 KEGG pathway enrichment analysis on key targets of drug pair of rhizoma atractylodes macrocephala and radix paeoniae alba in the treatment of IBS

3 讨论

目前，关于IBS的具体病因和发病机制仍不明确，认为其可能与遗传因素、饮食因素、精神心理因素、内脏高敏感、脑-肠轴调节异常、胃肠道动力异常、肠道感染与免疫因素和肠道微生物群等有一定关系[21-22]。

本研究通过网络药理学分析，获得白术-白芍药对中山柰酚、β-谷甾醇、3β-乙酰氧基苍术酮及儿茶素等20个潜在的关键活性成分，与IBS疾病靶点间存在AKT1、IL-6、TNF、PTGS2、JUN、CAT、CASP3及NOS3等55个交集靶点。

其中，AKT1为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的基因编码，可通过磷脂酰肌醇3激酶依赖的机制被胞外信号激活[23]。刘仕琦等[24]发现，七味白术散可通过调节PI3K/Akt信号通路上的IR、IRS-1、PI3K、Akt蛋白和mRNA的表达影响胰岛素分泌，达到治疗糖尿病的作用。IL-6与炎症反应具有密切关系，有文献报道，IBS患者的IL-6、IL-8、TNF-α水平显著升高[25]；通过电针治疗足三里，能够使大鼠IBS模型的IL-6水平降低[26]。研究结果发现，白术内酯Ⅲ能够通过抑制一氧化氮的产生，抑制TNF-α、IL-6及血管内皮生长因子活性，发挥抗炎作用[27]；山奈酚能够显著抑制LPS诱导的人单核细胞 THP-1的MAPK通路的表达，减少MDC、IP-10和IL-6等炎症因子产生，从而有效消除炎症[28]。此外，β-谷甾醇与豆甾醇也均可显著抑制IL-10、IL-6等的表达，减少由DSS诱导引起的高炎表达[29]。caspase-3是一种蛋白酶M，可参与细胞凋亡、坏死和炎症的信号转导，已发现IBS患者血清中caspase-3、Bax表达增加而Bcl-2减少，可促进神经元凋亡[30]。刘绮等[31]发现，芍药苷可显著上调佐剂性关节炎大鼠关节滑膜成纤维样滑膜细胞中Bax、caspase-3表达，抑制Bcl-2、IL-8等表达。

IBS患者在临床上存在不同程度的肠道低度炎症、免疫激活、黏膜屏障功能降低。通过KEGG分析发现，白术-白芍药对治疗IBS的信号通路包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、动脉粥样硬化信号通路、癌症信号通路、cGMP-PKG信号通路、钙离子信号通路、铂耐药性信号通路、HIF-1信号通路、雌激素信号通路等。其中，AGE-RAGE信号通路是涉及炎症反应的主要调控信号通路之一。RAGE在炎症反应中起促炎症介质的作用，AGEs是RAGE的重要配体，可直接或通过作用其受体RAGE激活MG，诱导其释放大量炎症因子IL-1β和TNF-α[32]。芍药总苷可通过改善类胰蛋白酶引起的肠上皮细胞屏障功能紊乱，降低内脏的高敏感性，有效减缓肠易激的腹泻和腹痛症状，并通过钙离子信号通路发挥对神经细胞的保护或治疗作用[33]。白术内酯Ⅲ可能作用于CRH、转化生长因子β1、SLC6A4、HTR2A及HTR3A等蛋白分子，通过调节神经或内分泌系统相关通路来影响内脏感觉传递和胃肠功能[34]。因此，推测白术-白芍药对可能是通过AGE-RAGE信号通路、钙离子信号通路等途径对IBS发挥治疗作用。

此外，在进一步的机制验证研究中，可先利用分子对接技术进行理论验证，即将白术-白芍药对中的关键活性成分山柰酚、3β-乙酰氧基、β-谷甾醇、儿茶素、8β-乙氧基白术内酯Ⅲ、芍药苷及谷甾醇等与AKT1、IL-6、TNF、PTGS2、JUN、CAT及CASP3等潜在关键靶点通过autodock 4.2软件进行对接分析，以结合能<-5 kJ/mol为标准评价活性成分与关键靶点间的结合性，再借助PyMol 2.3.4软件绘制成分与靶点对接模式图，以辅助验证生信分析结果的可靠性。在综合考虑理论分析结果的基础上，可通过致泻法结合束缚法等建立IBS动物(大鼠)模型，采用白术-白芍药对及其有效活性成分(如山柰酚、β-谷甾醇、芍药苷及白术内酯Ⅲ等)进行药物干预，通过Western-blot技术和Q-PCR技术对其AGE-RAGE信号通路、钙离子信号通路中关键蛋白、基因(AKT1、IL-6、TNF及JUN等)的水平表达变化进行检测，以最终验证预测推论的准确性。

综上所述，本研究通过网络药理学方法探讨了白术-白芍配伍治疗IBS的潜在物质基础和作用机制，理论上推测出白术-白芍药对中山柰酚、β-谷甾醇、3β-乙酰氧基苍术酮及儿茶素等活性成分通过作用于AKT1、IL-6、TNF及CASP3等靶点以调节AGE-RAGE信号通路、钙离子信号通路等而发挥治疗IBS的作用。