基于网络药理学的穿心莲抗骨质疏松分子机制研究

丁瑞恒 罗莹

1.首都医科大学附属复兴医院，北京 100038

2.广西医科大学，广西 南宁 530021

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种代谢性骨病，特征是骨量减少、骨组织的微结构异常和骨脆性增加[1-2]。其发病率随人口老龄化逐年上升，现已成为普遍关注的公共卫生问题。目前，临床治疗药物仅限于改善症状以延缓病情的进展，并且还报道了下颌骨坏死、非典型股骨骨折等不良反应[3]，亟待探索新的药物及治疗思路。

穿心莲(andrographis paniculata，AP)是一种传统药材，初步药理研究证明其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抑制血小板聚集等作用[4]，通常用于发热、炎症、腹泻等感染性疾病，无明显不良反应。穿心莲内酯是AP的主要活性成分之一，在破骨细胞相关骨疾病的治疗中有潜力[5-6]，但其作用机理仍然不清楚。

网络药理学是基于系统生物学的理论对生物系统的网络分析，该新兴学科运用网络可视化技术来揭示药物、基因、靶点之间复杂的生物网络关系[7-8]。网络药理学分析的关键步骤包括识别中药的有效活性成分及各活性成分的作用靶点、筛选疾病的作用靶点、构建“药物成分-疾病-靶点”网络、富集分析等。网络药理学分析结果可预测和揭示药物的作用机制，提高药物的治疗效果，降低毒副作用，从而提高新药临床试验的成功率，节省药物的研发费用。

在这项研究中，首先系统筛选了AP的活性化合物，并预测其可能的靶标。同时，搜索了与OP相关的已知潜在靶标，并进行注释和可视化。最后，借助网络拓扑分析，进一步预测AP抗OP作用的候选目标，并对靶点进行通路富集和分析，以探讨AP抗OP的分子机制。研究流程见图1。

图1 研究流程图Fig.1 The framework of this study

1 材料与方法

1.1 通过TCMSP鉴定活性化合物

使用关键词“穿心莲”从中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索与其相关的所有活性化合物，得到化合物结构、药物口服生物利用度(oral bio-avaliability，OB)、药物相似性(drug likeness，DL)、血脑屏障，水溶性等天然化合物的药代动力学特性，用于评估该天然化合物的ADME特点[9]。DL是为从候选药物中筛选具有适当的药代动力学特征并过滤不良特性分子而提出的概念[10]。高OB通常是确定生物活性分子DL指数的关键指标[11]。选择OB≥30%和DL≥0.18的化合物进行进一步研究。

1.2 通过PharmMapper识别潜在的药物靶点

从PubChem下载上一步筛选出的候选化合物结构的.sdf文件，并将其上传到PharmMapper数据库，选择“仅人类蛋白质靶标”，其他参数应用默认值。选择每个化合物排名前10位的潜在靶点并对结果做重复性筛查，剩余的蛋白质靶点进行下一步研究。

通过网络成像软件Cytoscape_3.6.1构建和分析“活性成分-靶标网络”，将以上获得的活性成分和靶点导入软件，网络中“节点”(node)代表分子和靶蛋白，“边”(edge)代表化合物与靶点之间的关系。

1.3 通过GeneCrads和CTD识别疾病相关靶标

使用关键词“osteoporosis”从GeneCrads和CTD数据库中搜索和筛选已知的疾病靶点。用维恩图删除搜索结果中重复的靶点。

1.4 GeneMaNIA分析

为了讨论AP与OP之间的关系，本研究提取了AP药物预测靶点和OP疾病靶点共享的蛋白质靶点，这些靶点的相互作用由GeneMANIA预测。选择物种为“人类”，检索目标基因。通过可视化的蛋白质互作关系，构建AP治疗OP的直接和间接目标调控网络。

1.5 通过DAVID作富集分析

将上述步骤获得的潜在靶点上传到DAVID 6.7服务器，选择<0.05进行功能注释聚类。

1.6 Cytoscape的网络建设

为了系统地了解AP对OP的治疗，在Cytoscape_3.6.1[12]中构建并分析靶点通路网络之间的复杂关系。

2 结果

2.1 穿心莲中的活性化合物

从TCMSP数据库中检索到AP的49种化合物，最终选择了符合DL≥0.18和OB≥30%的21种活性化合物(见表1)用于进一步研究。

表1 穿心莲的活性化合物Table 1 Active compounds in AP

2.2 AP的药物靶点预测

将21种AP活性化合物导入PharmMapper，总共获得206个相关的靶点蛋白，除重后保留109个靶点进行下一步研究。AP的靶点预测网络(见图2)由130个node和206个edge组成，network centralization为0.062，average number of neighbors为3.169。该网络包含一些具有high-Degree 和high betweenness centrality的化合物，这意味着它们连接多个靶蛋白，在网络中具有重要的意义。例如，MOL008239[槲皮素四甲基(3′，4′，5，7)醚]，MOL002928(木蝴蝶素A)和MOL008213(14-脱氧-12-甲氧基穿心莲内酯)，degree均=10，betweenness centrality分别为0.132 50、0.094 86和0.093 58。

图2 AP靶点网络(蓝色三角形：AP活性化合物；绿色倒三角形：蛋白质靶点；连线：化合物与蛋白质靶点之间的相互关系)Fig.2 Drug-target network (blue triangle: compound; green inverted triangle: protein target; edge: interaction between a compound and a protein)

2.3 骨质疏松症相关靶点

从Gene Cards和CTD数据库查找OP相关的疾病靶点并去除重复后，得到与OP相关的691个靶点(见图3)。

图3 用维恩图表示CTD和GeneCard之间的靶点关系(蓝色代表从CTD中查找到的靶点数量，黄色代表从GeneCard中找到的靶点数量)Fig.3 Venn map between CTD and GeneCards (blue represents the numbers of CTD; yellow represents the numbers of GeneCards)

2.4 GeneMANIA 分析

提取AP预测作用靶点和OP相关靶点之间共有的36个靶点。这些靶点的互作由GeneMANIA预测。结果表明36个靶基因之间存在丰富的互作关系，共表达29.85%，参与物理相互作用的比例为30.72%(见图4)。

图4 GeneMANIA分析关键靶点网络(黑色节点：靶蛋白；彩色线条：节点之间不同的相互作用)Fig.4 Network of potential targets analyzed using GeneMANIA (black nodes: target proteins; colored lines: different interactions)

2.5 GO富集和KEGG分析

使用DAVID 6.7的功能注释工具对上述36个关键基因进行富集分析，挖掘它们参与的主要信号通路。主要参与的前5项生物过程是：对有机物的响应、对内源性刺激的响应、对激素刺激的响应及对细胞内信号级联和细胞增殖的调节(见图5)。

图5 目标基因的Gene Ontology (GO) 分析Fig.5 Gene ontology (GO) analysis of therapy targets

共有22条通路与36个关键基因显著相关，其中Adherens junction通路和MAPK通路可能和骨质疏松疾病有直接关系(见表2)。

表2 关键蛋白的通路富集分析Table 2 KEGG pathway analysis of potential targets

本研究构建了靶标及其对应的重要信号通路的网络，以进一步阐明分子机制，结果发现其网络由43个节点和112个交互组成(见图6)。

图6 AP的药物靶点和通路网络(蓝色方块：通路；粉色圆圈：靶点；连线：它们之间的相互作用)Fig.6 Target-pathway network for AP (blue square: pathway; pink circle: targets; edges: the interactions among them)

3 讨论

本研究使用网络药理学技术来筛选穿心莲活性成分。根据OB和DL参数筛选出穿心莲的有效成分，建立了“有效成分-药物靶点-疾病靶点”的功能关系网络并进行分析。基于分析结果，提示穿心莲的入血活性成分之间存在协同作用，直接和间接在骨质疏松症的发生发展中发挥不同的作用，具有治疗骨质疏松的潜力。

抗骨质疏松药物主要通过维持成骨细胞形成与破骨细胞吸收之间的平衡来实现骨骼的代谢稳态。本研究富集分析的结果显示，穿心莲可能直接和间接地影响和调节骨骼代谢。穿心莲直接影响骨代谢的途径，有Adherens junction和MAPK信号通路传导。已有研究表明，软骨膜中成骨细胞之间通过N-钙粘连蛋白Adherens junction信号传导对于软骨内骨生长至关重要。Guntur等[13]研究了N-钙粘连蛋白介导的黏附连接是否在骨发育过程中起作用，他们观察到没有β-连环蛋白的软骨膜中黏附连接和AKT信号的减少，N-钙粘连蛋白对成骨细胞间连接的调节受成骨细胞基因转录的影响。MAPK信号通路对于骨骼发育和维持骨平衡具有重要作用[14-15]。ERK-MAPK信号传导是成骨细胞在体外增殖分化以及体内骨骼发育的主要组成部分[15]。

此外，本研究富集的信号通路中，有一些信号通路可调节其他系统从而间接影响骨代谢的平衡，如神经营养因子、VEGF、ErbB、Toll样受体、胰岛素等信号通路。提示穿心莲可通过神经、循环、内分泌等系统的新陈代谢间接影响或干扰骨骼微环境，从而促进成骨细胞的增殖或抑制破骨细胞的生成。胰岛素信号通路通过影响成骨细胞和破骨细胞的发育，在骨骼的生长和更新中作用重大。成骨细胞内的胰岛素信号传导途径受损，可影响成骨细胞的增殖、分化和存活，最终导致骨质量受损[16]。

本研究表明，穿心莲具有多种生物活性，可能成为治疗骨质疏松症的潜力药物，目前其主要活性成分穿心莲内酯已有一些研究的报道。穿心莲内酯具有激活经典的Wnt信号通路的能力，这对于治疗骨质疏松症至关重要[17]。穿心莲内酯可能通过上调ERK信号通路中相关蛋白的表达来促进成骨细胞的增殖[18]。穿心莲内酯可预防破骨细胞相关的骨吸收[5]，并抑制牙龈卟啉单胞菌引起的牙槽骨吸收[19]。穿心莲内酯可能通过激活成骨细胞中的Wnt/β-Catenin信号通路来促进成骨潜力[13]。穿心莲内酯还可以通过阻断鼠巨噬细胞中的NF-κB信号通路来抑制破骨细胞生成[20]，并通过抑制TNF-α诱导的NF-κB信号通路来促进成骨分化[21]。此外，穿心莲内酯通过抑制RANKL信号通路来抑制卵巢切除术引起的骨丢失[22]。这些研究支持穿心莲内酯对骨骼代谢的直接影响。另一方面，有文献还报道了穿心莲内酯对骨骼代谢的间接影响。Mittal等[23]报道穿心莲内酯与腺苷A2a受体结合以激活Nrf-2转录，并通过失活GSK-3β来抑制其从细胞核中的排斥，这些结果共同导致抗氧化酶血红素加氧酶-1(HO-1)的激活，因此可以推测穿心莲内酯可以用作对抗与氧化应激有关的各种疾病，例如骨质疏松症。此外，穿心莲片对围绝经期牙周炎患者的骨代谢和内分泌都具有调节作用，疗效高并且安全[24]。

综上所述，穿心莲的有效活性成分可用于骨质疏松症发生发展中多靶点和多系统的综合干预。利用网络药理学的方法分析药物与疾病靶标之间的互作关系，可以为进一步优化骨质疏松症临床治疗的实验设计提供重要的研究依据，并为药物开发提供新思路。