黄瓜籽总皂苷对MC3T3-E1细胞分化及SPARC、OPG/RANKL表达的影响

孙银玲 陈丽艳 张蕾 王萍 綦菲 曹阳 王伟明*

1.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036

2.黑龙江护理高等专科学校，黑龙江 哈尔滨 150080

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨组织微结构破坏为特征的全身代谢性骨病，可导致骨脆性和骨折风险增加[1]。2018年国家卫生健康委员会对骨质疏松进行首次全国流行病学调查，结果显示65岁以上老年人群骨质疏松患病率高达32%[2]。因为潜在的破坏性结果和高的骨折累计率，骨质疏松症很大程度关系到社会老龄化问题[1，3]。

黄瓜籽又名哈力苏，为葫芦科植物黄瓜(Cucumis sativus L.)的种子[4]。《中华本草》中记载其具有续筋接骨、祛风、消痰的功效，主治骨折筋伤、风湿痹痛、老年痰喘等症[5]，在民间用于治疗骨质疏松症也具有悠久的应用历史。现代研究显示黄瓜籽具有补钙、壮骨、抗疲劳等多种功效，可药食兼用而备受青睐[3]。本研究通过考察黄瓜籽总皂苷提取物(cucumber seed saponins，CSS)对小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化的作用，以及对SPARC、OPG/RANKL/RANK信号通路mRNA和蛋白表达的影响，从细胞学水平探讨黄瓜籽总皂苷促进骨形成的作用机制，为其防治骨质疏松症的应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 细胞株和主要试剂

小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1(subclone 14)购于中国科学院细胞库(货号：GNM15)；α-MEM培养基(HyClone，Cat. No. SH30265.01B)，胎牛血清(四季青，低内毒素)，0.25% Trypsin-EDTA(HyClone)；ALP活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；兔多克隆抗体SPARC(ab203284)、兔多克隆抗体OPG(ab9986)、兔单克隆抗体RANKL(ab124797)及兔多克隆抗体β-actin(ab8227)(Abcam公司)；辣根酶标记抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa公司)；GoTaq©PCR Master Mix试剂盒(Promega公司)。

1.2 药物

黄瓜籽购于河北省康派中药材有限公司，经黑龙江省中医药科学院王伟明研究员鉴定为葫芦科植物黄瓜(Cucumis sativus L.)的干燥成熟种子，黄瓜籽总皂苷提取方法同参考文献[6]。取100 mg黄瓜籽总皂苷提取物加入1 mL DMSO中制成100 mg/mL的储备液，保存于-20 ℃备用。

1.3 方法

1.3.1MTT细胞增殖实验：MC3T3-E1细胞培养(传代、冻存和复苏)按常规方法。将细胞以(3～5)×104个细胞/孔的密度接种于96孔板，分别加入180 μL不同浓度含药无血清培养基，其中黄瓜籽总皂苷提取物(CSS)终浓度分别为10-1、10-2、10-3mg/mL，雷洛昔芬(raloxifene)终浓度1 μmol/L为阳性对照，0.1% DMSO为阴性对照，及不含细胞的空白组，每组设3个平行孔。继续培养48 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，孵育4 h，弃去各孔液体，加入150 μL DMSO溶解，544 nm波长下测定各孔的吸光度。

1.3.2ALP活性检测：细胞培养及给药方法如1.3.1，按照ALP测定试剂盒提供方法检测胞外ALP活性，在520 nm波长下测定样品及标准品的吸光度，ALP活力(金氏单位/100 mL)=7.14 U/L[7-9]。

1.3.3细胞钙化结节数量测定：为诱导MC3T3-E1细胞分化为成熟的成骨细胞，细胞在含药的成骨诱导培养基(含有10 mmol/L β-甘油磷酸钠及50 μg/mL L-抗坏血酸的完全α-MEM培养基)培养28 d，每组设3个平行孔。培养结束后PBS清洗，加入无水乙醇固定10 min，双蒸水清洗3次。加入0.5%茜素红-Tris-HCl (pH=4.3)，于37 ℃染色30 min至1 h，双蒸水冲洗后，利用显微镜每个样本随机选取10个视野进行观察[1，9-11]，应用Image-Pro Plus6.0软件进行统计。

1.3.4RT-PCR检测基因表达：MC3T3-E1细胞在含药的α-MEM完全培养基中分别培养48 h，每组设3个平行孔。利用Trizol法提取细胞总RNA，定量后进行反转录。RT-PCR反应条件：①预变性 95 ℃ 2 min；②变性95 ℃ 15 s；③退火60 ℃ 1 min，共40 cycle；④延伸72 ℃，5 min。检测SPARC、OPG、RANKL的基因表达，以β-actin为内参，引物序列见表1。采用2-ΔΔCT法对基因进行相对定量分析。

1.3.5Western blot检测蛋白表达：MC3T3-E1细胞在含药的α-MEM完全培养基中分别培养48 h，每组设3个平行孔。提取各组细胞总蛋白，BCA法检测蛋白质浓度后，Western blot检测β-actin、SPARC、OPG、RANKL的蛋白表达。孵育一抗β-actin(1∶1000)，SPARC(1∶1000)，OPG(1∶500)，RANKL(1∶1000)，选择相应的二抗孵育后，采用DAB辣根过氧化酶法显色，利用Quantity One测定灰度值。

1.4 统计学分析

所有数据采用SPSS 24 统计学软件进行统计分析，采用GraphPad Prism 6作图，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CSS对MC3T3-E1细胞增殖的影响

MC3T3-E1细胞加入各组药物培养48 h后，结果表明(图1)，与阳性对照组相比，CSS给药组对MC3T3-E1的增殖作用随着浓度的升高而显著增强(P<0.05)。

2.2 CSS对MC3T3-E1细胞分化的影响

ALP是成骨早期的标志物。结果如图2所示，MC3T3-E1细胞加入各组药物培养48 h后，与空白组相比，CSS及阳性对照组处理MC3T3-E1细胞后ALP活性均显著升高(P<0.01)；与阳性对照组相比，10-1mg/mL、10-2mg/mL CSS作用于细胞后ALP活性明显升高(P<0.05)。

图2 不同剂量CSS对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响Fig.2 The effect of the different doses of CSS on the differentiation in MC3T3-E1 cells

2.3 CSS对MC3T3-E1细胞矿化的影响

茜素红染色结果见图3和表2，与空白组相比，CSS组和阳性对照组钙化结节面积明显增多(P<0.05)；与阳性对照组相比，CSS 10-1mg/mL和10-2mg/mL钙化结节面积明显增多(P<0.05)，CSS 10-3mg/mL差异无统计学意义(P>0.05)。

图3 不同剂量CSS对MC3T3-E1细胞矿化的影响A：CSS 10-1mg/mL组；B：CSS 10-2mg/mL组；C：雷洛昔芬组；D：对照组Fig.3 The effect of different doses of CSS on cellular mineralization in MC3T3-E1 cellsA: CSS 10-1 mg/mL; B:CSS 10-2 mg/mL; C: Raloxifene; D:Control

表2 CSS对MC3T3-E1细胞矿化的影响Table 2 The effect of CSS on cellular mineralization

2.4 CSS对MC3T3-E1细胞OPG/RANKL及SPARC mRNA表达的影响

RT-PCR结果如图4，与空白组相比，不同剂量的CSS组及阳性对照组SPARC、OPG/RANKL mRNA表达量均明显增高(P<0.05)；与阳性对照组相比，CSS高剂量组SPARC、OPG/RANKL mRNA表达量明显升高(P<0.05)。

图4 不同剂量CSS对MC3T3-E1细胞SPARC、OPG/RANKL mRNA表达的影响Fig.4 The effect of CSS on SPARC and OPG/RANKL mRNAs in MC3T3-E1 cells

2.5 CSS对MC3T3-E1细胞OPG/RANKL及SPARC蛋白表达的影响

Western blot结果见图5，与空白组相比，CSS高、中剂量组及阳性对照组OPG/RANKL蛋白表达均明显升高(P<0.05)；与阳性对照组相比，CSS高剂量组OPG/RANKL蛋白表达量明显升高(P<0.05)。与空白组相比，不同剂量CSS组及阳性对照组SPARC蛋白表达量明显升高(P<0.05)；与阳性对照组相比，CSS高、低剂量组SPARC蛋白表达量明显升高(P<0.05)。

图5 不同剂量CSS对MC3T3-E1细胞SPARC、OPG/RANKL蛋白表达的影响Fig.5 The protein expressions of SPARC and OPG/RANKL in MC3T3-E1 cells treatment with different doses of CSS

3 讨论

骨组织是不断重建的动态组织器官，其重建过程涉及血管的生成及局部骨微环境的构建。重建过程由成骨细胞和破骨细胞介导，通过去除旧的骨组织并产生新的骨组织而不断更新。目前针对骨质疏松症最理想的治疗是在刺激新骨形成的同时，能够纠正具有骨质疏松特征的骨小梁微体系结构失衡，为骨质疏松症的治疗提供新的选择[12]。

黄瓜籽中主要含有矿物质元素、脂肪酸、糖类、苷类和植物甾醇类成分[4]，在民间多用于接骨壮骨，近几年多项研究表明黄瓜籽具有抗骨质疏松症作用，章舒[13]研究发现黄瓜籽粉能够预防绝经后骨质疏松症，且可能通过调节OPG/RANK/RANKL信号通路发挥作用。蔡伟明等[14]研究发现黄瓜籽多肽能够促进原代培养成骨细胞增殖、分化及矿化。李娜等[15]研究发现黄瓜籽乙酸乙酯提取物能够提高MG63细胞活性及ALP含量，并能够促进BMP-2表达。裴启洋等[16]研究发现黄瓜籽不同提取部位均能促进成骨细胞增殖，同时正丁醇、乙酸乙酯提取部位能够提高成骨细胞的碱性磷酸酶活性及骨钙素分泌，从而达到促进骨形成和修复的目的。本研究通过考察黄瓜籽总皂苷提取物小鼠颅顶成骨细胞MC3T3-E1的增殖、分化及矿化作用，揭示黄瓜籽抗骨质疏松的部分作用机制。

骨形成及骨吸收的平衡受多种细胞信号、激素及生长因子的调控，其中RANKL及其两个受体RANK和OPG具有重要作用，在骨的微环境中成骨细胞表达OPG/RANKL的相对比例对于破骨细胞的活性至关重要，并且上调该比例能够减少破骨细胞的分化及成熟，因而被认为是骨质疏松症治疗的一种策略[1，17]。SPARC也称为骨粘连蛋白，在骨形成过程中由成骨细胞分泌，在调节骨骼重塑以及维持骨量方面起着重要作用，在细胞外基质中，SPARC与胶原蛋白在骨骼中的沉积、矿物质结合及骨基质矿化密切相关。体内研究发现无SPARC小鼠成骨细胞和破骨细胞数量减少，骨形成速率降低，骨流失速率增加，导致骨量减少[17]。因此，OPG/RANKL/RANK及SPARC在骨骼的重塑中起重要作用。

成骨细胞在骨形成中主要由增殖、分化和基质矿化3个步骤组成。在细胞增殖和基质成熟期，与成骨细胞表型和分化相关的特定蛋白ALP可以检测到。ALP是成骨细胞的功能酶，能够水解有机磷酸酯，使成骨细胞基质中局部磷酸根浓度增加，促进羟基磷灰石的形成、沉积、以及基质的钙化，同时水解焦磷酸，破坏钙化抑制剂，从而启动基质钙化[19-20]。

本研究以MC3T3-E1细胞的增殖、ALP活性、钙化结节形成以及OPG/RANKL、SPARC表达为指标，考察黄瓜籽总皂苷提取物对MC3T3-E1成骨样细胞的影响。结果表明，黄瓜籽总皂苷在体外能够促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化，并具有一定的剂量依赖性。高剂量的黄瓜籽总皂苷对于成骨重要因子SPARC及OPG/RANKL的比率均具有明显的上调作用，提示其能促进成骨细胞分化，为黄瓜籽在骨质疏松症方面的应用提供依据和基础。