黄豆渣酱的品质分析及其抗氧化活性

许春艳，杨春晖，鞠 岩，王 鹏，2，续丹丹，2，张 健，2，王文平*

（1.北京食品科学研究院，北京 100068；2.北京市食品酿造研究所有限责任公司，北京 100050）

黄豆渣是豆腐、豆浆、腐乳等豆制品加工过程中的主要副产物，其营养丰富，主要包括膳食纤维、蛋白质、脂肪、维生素及矿物质元素等，还含有异黄酮、皂苷等抗氧化活性成分，具有调节肠道菌群、辅助糖尿病治疗等保健功能[1-2]。但豆渣因颗粒大、口感粗糙，水分含量高、易腐烂、不易贮存等原因，长期被人们忽视，多作为畜禽饲料或直接废弃，造成极大的资源浪费及环境污染。

目前，豆渣主要用于豆渣饲料加工[3]、功能成分[4-5]提取、豆渣食品研制[6-9]、制曲[10]、培养基制作[11]等，也有很多发酵豆渣的研究[12-13]。申春莉等[14]采用灵芝菌丝体固态发酵豆渣后，总膳食纤维及脂肪含量下降，而可溶性蛋白、氨基酸态氮及多肽含量升高；GUPTA S等[15]研究发现，益生菌发酵豆渣后，豆渣的营养成分得到改善，抗氧化活性提高。

目前，对豆渣发酵产品多停留在前发酵阶段或制曲阶段，缺少对后发酵过程中豆渣酱各种营养成分及风味成分的研究[16-18]。本研究以豆渣为主要原料，采用米曲霉（Aspergillus oryzae）AS3.951制曲后进行发酵，制备黄豆渣酱，按照国标方法对其感官、理化及微生物指标进行测定，采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）、氨基酸自动分析仪、超高效液相色谱串联四级杆质谱（ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分别对其挥发性风味成分、游离氨基酸、异黄酮及酚类物质进行测定，并考察其对体外抗氧化活性，以期实现豆渣的高值化利用，减少资源浪费。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆渣：自制；小麦粉、食盐：市售；米曲霉（Aspergillusoryzae）AS3.951（沪酿3.042）曲精：北京市食品酿造研究所；氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；福林酚（分析纯）、碳酸钠（分析纯）、维生素C（vitamin C，VC）（分析纯）、氨基酸标准品（纯度＞98%）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均为分析纯）：美国Sigma公司；黄酮及多酚单体标准品（纯度均＞98%）：上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：德国默克有限公司。

1.2 仪器与设备

DHG-9051A电热恒温干燥箱、DHP-9051B微生物培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；KJELTEC 2300凯氏定氮仪：美国FOSS公司；722型数显可见分光光度计：上海光学仪器五厂有限公司；1290 infinity II-6470超高效液相色谱串联四级杆质谱仪、5975-7890A气相色谱-质谱仪：美国Agilent科技有限公司；5424高速冷冻离心机：德国Eppendorf科技有限公司；L-8900全自动氨基酸分析仪：日本日立科技有限公司；65 μm PDMS/DVB萃取头：美国Supelco有限公司；DT-FXG发酵罐：浙江东铁机械设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 黄豆渣酱加工工艺流程及操作要点[19]

操作要点：

黄豆渣、蒸煮：取生产腐乳后的残余黄豆渣，在压力0.1 MPa、温度121 ℃条件下蒸煮40 min，保温保压2 h，获得熟料。

冷却、混匀：待黄豆渣熟料于冷却槽中自然降温至60 ℃时与小麦粉按质量比3∶2混合均匀。

制曲：当混合物料冷却至35 ℃时，接种质量比为0.07%的米曲霉AS3.951曲精，搅拌均匀后，在30 ℃条件下培养48 h，每4～6 h翻曲一次，制得曲料；此时曲料呈黄绿色，表面有孢子。

发酵：在曲料中拌入20°Bé的盐水（温度50 ℃），盐水与曲料质量比为5∶3，搅拌均匀后放入发酵罐中，每个发酵罐中加入10 kg曲料，于42 ℃条件下进行发酵，每天搅拌一次，发酵60 d。

灭菌、灌装：发酵产物灭菌后灌装即得黄豆渣酱成品。

1.3.2 黄豆渣酱基本指标的测定

（1）感官指标

按照GB 2718—2014《食品安全国家标准酿造酱》对黄豆渣酱的色泽、滋味、气味及状态进行感官评价。

（2）理化指标

水分含量：按照GB 5009—2016《食品中水分的测定》测定；铵盐含量：按照GB 5009.234—2016《食品中铵盐的测定》测定；氨基酸态氮含量：按照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》测定；总氮含量：按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》测定；总酸含量：按照GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》测定；还原糖含量：按照GB 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》测定；食盐含量：按照GB 5009.44—2016《食品中氯化物的测定》测定。

（3）微生物指标

沙门氏菌、金黄色葡萄球菌：按照GB 29921—2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》测定；大肠菌群：按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》测定。

1.3.3 黄豆渣酱挥发性风味物质的测定

样品处理：准确称取4.0 g黄豆渣酱样品于20 mL顶空瓶中，加入1.0 g氯化钠调节离子强度，吸取内标物3-辛醇溶液（100 μg/mL）10 μL。用65 μm PDMS/DVB萃取头对样品中的挥发性风味化合物进行富集提取。萃取温度50 ℃，萃取时间40 min，振荡速率200 r/min，振荡时间40 min。萃取后于气相色谱仪进样口解吸5 min，进行GC-MS分析。

GC条件：HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气（He），流速1.0 mL/min，采用不分流模式进样；进样口温度250 ℃。升温程序：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至100 ℃，再以6 ℃/min的速度升至220 ℃并保持10 min。

MS条件：电离方式为电子离子（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃；扫描模式为全扫描，扫描范围35～400 amu。

定性及定量方法：采用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）08谱库检索进行化合物组成的分析，保留匹配度＞750的化合物；采用半定量法定量。

1.3.4 黄豆渣酱游离氨基酸组成的测定

按照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》测定黄豆渣酱中游离氨基酸的含量。

1.3.5 黄豆渣酱活性成分分析

大豆异黄酮及酚类化合物含量的测定采用UPLC-MS/MS法[20]并进行修改。液相色谱条件：色谱柱为Eclipse plusC18色谱柱（50 mm×3.0 mm，1.8 μm），柱温40 ℃，流速0.4 mL/min。流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为甲醇，流动相梯度洗脱程序：0～1 min，90%A；1～6 min，90%～40%A；6～10 min，40%～10%A；10～12 min，10%A，12～14 min，90%A。进样量1.0 μL。质谱条件：采用电喷雾离子（electron spray ionization，ESI）源，负离子模式，喷雾电压3 000 V，辅助气气化温度200 ℃，鞘气流速11 mL/min，鞘气温度325 ℃。根据标准品保留时间定性，采用外标法进行定量。

1.3.6 抗氧化能力分析

DPPH、ABTS自由基清除能力的测定：参考张欢欢等[21]的方法。分别测定不同质量浓度的黄豆渣酱对DPPH和ABTS自由基的清除率，并计算出黄豆渣酱清除DPPH和ABTS自由基的半抑制浓度（half maximal inhibitory concen tration，IC50）值。以抗坏血酸作为自由基清除能力当量物质，配制不同浓度的抗坏血酸溶液，分别以其浓度（x）和自由基清除率（y）为横纵坐标，绘制标准曲线（y（DPPH自由基清除率）=0.894 2x+1.605 5，R2=0.997；y（ABTS自由基清除率）=0.688 9x-0.321 3，R2=0.996），并计算DPPH和ABTS自由基清除能力，以μmol维生素C当量（vitamin C equivalent，VCE）/g表示。

1.3.7 数据处理与分析

采用OriginPro 8.5.1软件对试验数据进行统计与分析；试验重复3次，结果以平均值的形式表示。

2 结果与分析

2.1 黄豆渣酱的感官指标

由表1可知，黄豆渣酱呈棕褐色，有光泽；味鲜醇厚，咸甜适口，无苦、焦糊及其他异味；有浓厚的酱香和酯香；无霉斑、无外来异物，其感官指标符合GB 2718—2014《食品安全国家标准酿造酱》要求。

表1 黄豆渣酱的感官指标Table 1 Sensory indexes of soybean residue paste

2.2 黄豆渣酱的理化指标

由表2可知，黄豆渣酱的氨基酸态氮含量达到0.44g/100g，高于GB 2718—2014《食品安全国家标准酿造酱》要求≥0.30 g/100 g，其他理化指标均满足国标要求。

表2 黄豆渣酱理化指标的测定结果Table 2 Determination results of physical and chemical indexes of soybean residue paste

2.3 黄豆渣酱的微生物指标

由表3可知，黄豆渣酱中大肠菌群＜10 CFU/g，致病菌沙门氏菌未检出，金黄色葡萄球菌＜10 CFU/g，结果表明，黄豆渣酱微生物指标满足GB 29921—2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》及GB 2718—2014《食品安全国家标准酿造酱》要求。

表3 黄豆渣酱微生物指标的测定结果Table 3 Determination results of microbial indexes of soybean residue paste

2.4 黄豆渣酱中挥发性风味成分分析

采用GC-MS测定黄豆渣酱中的挥发性风味成分，挥发性成分种类及含量见表4。

表4 黄豆渣酱中挥发性风味化合物GC-MS分析结果Table 4 Results of volatile flavor substances in soybean residue paste analyzed by GC-MS

续表

由表4可知，通过GC-MS分析，从黄豆渣酱中共鉴定出60种挥发性风味化合物，包括醇类（4种）、酸类（12种）、酯类（11种）、醛类（11种）、酮类（6种）、酚类（3种）和其他类（13种），其中，其他类含量（7 346.39 μg/100 g）最高，酸类物质含量（2 234.93 μg/100 g）次之，酚类物质含量（243.98 μg/100 g）最少。这些挥发性化合物互相融合，共同形成了黄豆渣酱味鲜醇厚，酱香和酯香浓厚的独特风味。

醇类物质主要是在发酵过程中由微生物代谢、不饱和脂肪酸降解及羰基化合物的还原反应生成的，具有芳香和植物香气[22]。从黄豆渣酱中共检出4种醇类物质，包括正辛醇、苯乙醇、乙醇及苯甲醇。其中，正辛醇含量（500.00μg/100g）最高，苯乙醇含量（227.41 μg/100 g）次之，苯乙醇具有新鲜面包味和玫瑰花香[23]。

酸类物质可能是由微生物产生的脂肪酶对大豆油脂降解所产生，低分子质量脂肪酸也可能通过酵母或乳酸菌代谢生成[24]。从黄豆渣酱中共检出12种酸类物质，包括乙酸、3-甲基丁酸、甲基丙二酸、2-甲基丙酸等。除乙酸外，3-甲基丁酸含量（445.78 μg/100 g）最高，其具有辛辣味、酸味及尖刺的奶酪味[20，25]。

酯类物质是由脂肪氧化产生的醇和游离脂肪酸相互作用形成的，主要呈水果香味。从黄豆渣酱中共检测出11种酯类物质，包括丁二酸单甲酯、十六烷酸乙酯、（E）-9-十八烯酸乙酯、9,12-十八烯酸乙酯、苯乙酸乙酯、3-羟基-2,3,4,5-四甲基-戊酸乙酯、乙酸乙烯酯等。其中，丁二酸单甲酯含量（173.19μg/100g）最高，其次为十六烷酸乙酯（103.92μg/100g）。

醛酮类化合物一般由氨基酸脱氨脱羧、酮酸脱羧、醇氧化等化学反应生成。从黄豆渣酱中共检出11种醛类和6种酮类，醛类物质包括5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、5-甲基-2-糠醛、苯甲醛等，酮类物质包括2-叔丁基-5-甲基[1，3]二氧戊环-4-酮、3-羟基-2-丁酮等。其中，糠醛呈甜香、杏仁香气，对国内酱的风味贡献较大[26]。康蕾[27]也从黄豆酱中检测出了3-羟基-2-丁酮。

酚类物质主要是在发酵过程中通过曲霉的降解作用产生[28]。从黄豆渣酱中共检出3种酚类物质，含量为243.98μg/100g，包括4-乙基-2-甲氧基苯酚、苯酚及2-甲氧基酚。其中，4-乙基-2-甲氧基苯酚含量（129.52 μg/100 g）最高。

此外，黄豆渣酱中还检出呋喃类、吡嗪类等其他物质，吡嗪类化合物主要由微生物代谢或美拉德反应生成，四甲基吡嗪能为黄豆渣酱提供烘烤可可和坚果的香气[29]。麦芽酚具有焦糖香气，香气浓郁[30]。

2.5 黄豆渣酱中游离氨基酸分析

有研究表明，豆渣经微生物发酵后，很多性能均能得到很好的改善[31]。米曲霉发酵豆渣过程中能分泌蛋白酶，具有分解蛋白质的性能，使发酵产品中富含氨基酸等多种易被人体吸收的成分[32]。因此，对黄豆渣酱中的游离氨基酸进行检测分析，结果见表5。

表5 黄豆渣酱中游离氨基酸的测定结果Table 5 Determination results of free amino acids in soybean residue paste

由表5可知，从黄豆渣酱中共检出18种游离氨基酸，总含量为1.403 g/100 g，其中包含7种必需氨基酸（essential amino acid，EAA），含量为0.593 g/100 g，EAA与总氨基酸（total essential amino acid，TAA）含量的比值为0.423，与非必需氨基酸（nonessential amino acid，NNEAA）含量的比值为0.732。根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）在1973年提出的理想蛋白模式中EAA/TAA在0.40左右、EAA/NEAA在0.60以上的蛋白质营养价值较好[33]，说明黄豆渣酱中的游离氨基酸含量丰富，蛋白质达到理想蛋白质的要求。18种游离氨基酸中包含2种鲜味氨基酸，6种甜味氨基酸，8种苦味氨基酸，1种酸味氨基酸及1种无味氨基酸，苦味氨基酸（0.538 g/100 g）＞甜味氨基酸（0.532 g/100 g）＞鲜味氨基酸（0.313 g/100 g）＞无味氨基酸（0.014 g/100 g）＞酸味氨基酸（0.006 g/100 g）。相对于谷类食品，黄豆渣酱中含有丰富的赖氨酸（0.062 g/100 g），是人体难以合成的，且是一般植物所缺少的，因此多吃黄豆渣食品，有助于弥补谷物中赖氨酸的不足；黄豆渣酱中的支链氨基酸（Leu、Ile、Val）含量较高，而芳香族氨基酸（Phe、Tyr）含量较低，恰与动物蛋白的氨基酸组成互补。

2.6 黄豆渣酱抗氧化能力分析

2.6.1 黄豆渣中异黄酮及酚类物质分析

由表6可知，从黄豆渣酱中检测出9种异黄酮类物质，包括大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、鸢尾黄酮苷、大豆苷元、染料木素、鸢尾黄素、鹰嘴豆芽素A及黄豆黄素，其中，染料木素含量最高，为4 655.363 g/100 g，其次为大豆苷元（3 857.448 g/100 g）。从黄豆渣酱中检测出7种酚类物质，包括原儿茶素、没食子酸、表没食子儿茶素、咖啡酸、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯及阿魏酸，其中，咖啡酸含量最高，为39.869 g/100 g，其次为原儿茶素（23.287 g/100 g）。结果表明，黄豆渣酱含有丰富的异黄酮及酚类等活性物质。

表6 黄豆渣酱中异黄酮及酚类物质的检测结果Table 6 Determination results of isoflavones and polyphenol substances in soybean residue paste

2.6.2 抗氧化能力分析

由图1可知，随着黄豆渣酱质量浓度的升高，ABTS自由基及DPPH自由基的清除率均呈先升高后趋于平缓的趋势。黄豆渣酱清除ABTS自由基的IC50值为36.523 μmol VCE/g，清除DPPH自由基的IC50值为10.824 μmol VCE/g。说明黄豆渣酱具有很好的抗氧化能力，分析原因可能与黄豆渣酱中含有丰富的异黄酮及酚类物质有关[34]。

图1 黄豆渣酱对ABTS（a）及DPPH自由基（b）的清除能力Fig.1 Scavenging capacity of soybean residue paste against ABTS (a)and DPPH free radical (b)

3 结论

以豆渣为主要原料，采用米曲霉（Aspergillus oryzae）AS3.951制曲后发酵制备黄豆渣酱。黄豆渣酱的感官、理化及微生物指标均符合相关国标要求。采用GC-MS从黄豆渣酱中共检测出60种挥发性风味成分，包括4种醇类、12种酸类、11种酯类、11种醛类、6种酮类、3种酚类和13种其他类物质；采用氨基酸自动分析仪从黄豆渣酱中共检出18种游离氨基酸，总含量为1.403 g/100 g，其中7种EAA含量为0.593 g/100 g；黄豆渣酱中含有丰富的异黄酮、酚类物质，具有较好的抗氧化能力，清除ABTS自由基的IC50值为36.523 μmolVCE/g，清除DPPH自由基的IC50值为10.824μmolVCE/g。该研究为实现豆渣的高值化利用奠定了基础。