一种猪肺炎支原体阳性血清的制备方法

黄玉婷 兆丰华生物科技（福州）有限公司 福州 350014

猪支原体肺炎 （Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的猪的一种接触性呼吸系统传染病，在我国也称为猪喘气病。该病发病率高、病死率低，但由于其流行的广泛性、长期性、消耗性，常常降低猪只的平均日增重和饲料转化率，给养猪业带来巨大的经济损失[1]。

目前，疫苗免疫接种是预防和净化猪支原体肺炎最经济有效的手段[2]。根据《兽药质量标准》2017年版生物制品卷规定，猪支原体肺炎活疫苗必须进行鉴别检验，该项检验需用抗Mhp特异性血清（AGP效价≥1:8）对样品进行中和。本研究以兔作为试验动物，建立猪肺炎支原体阳性血清制备方法，不但成本相较于猪低，同时降低了同源动物其它外源病毒的污染风险，为猪肺炎支原体研究、诊断、鉴别等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 体重1.5～3.0 kg新西兰兔，购自上海市松联试验动物场。

1.1.2 猪肺炎支原体（168株）抗原 由兆丰华生物科技（福州）有限公司生产，效价为109CCU/mL。

1.1.3 猪支原体肺炎活疫苗（168株） 由兆丰华生物科技 （福州）有限公司生产，效价为108CCU/头份。

1.1.4 猪鼻支原体（CVCC361） 购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 方法

1.2.1 灭活疫苗制备 将猪肺炎支原体（168株）抗原用灭活剂进行灭活后乳化，制备猪支原体肺炎灭活疫苗，分装备用。

1.2.2 动物筛选 挑选体重1.5～3.0 kg大兔，按照表1中列出的检测方法和判定标准，对猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒等相关抗原抗体进行检测。

1.2.3 动物免疫 按表1方法，挑选3只符合要求且生长状况接近的健康雄性大兔，按表2方法进行免疫接种，当达到效价后收获血清。

表1 动物筛选检测项目

表2 猪肺炎支原体阳性血清免疫程序

1.2.4 血清的采集与分离 四免后每周采集兔血清并监测抗体水平，当抗体水平达到要求时，用无菌心脏采血法收获并分离血清。

1.2.5 分装保存 将混合均匀的血清进行无菌分装，并放置于-20℃以下保存。

1.2.6 琼脂扩散试验 称取一定量琼脂粉，按1%比例加入8%生理盐水热溶，将融化的琼脂倒入直径9 cm平板，每块平板25 mL左右，待琼脂冷却后用直径3 mm梅花形打孔器打孔，酒精灯封底。吸取2倍稀释的肺炎支原体抗原至中间孔，所制备的阳性血清按2倍系列稀释加样。加样后，将琼脂平板倒置放入湿盒，于37℃培养24 h后观察结果。

1.2.7 物理性状、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验 按《中国兽药典》方法进行检测[3]。

1.2.8 猪常见病原检测 按表1方法对猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒等相关抗原抗体进行检测。并将猪鼻支原体抗原与所制备的阳性血清进行琼脂扩散试验，观察抗原孔与阳性血清孔之间是否有沉淀产生。

1.2.9 细菌内毒素测定 按《中国兽药典》方法进行检测[4]。

1.2.10 鉴别检验 将猪支原体肺炎活疫苗（168株）做10倍系列稀释至10-4CCU/mL，与等量所制备的阳性血清混合，在37℃水浴中和2 h，取0.2 mL接种至1.8 mL液体KM2培养基，培养、观察15 d。同时设猪肺炎支原体阴性血清中和对照组、培养基对照组、病毒对照组，观察培养基变色情况。

1.2.11 重复性试验 公司不同试验人员做对比试验，按本试验方法挑选3只符合要求且生长状况接近的健康雄性大兔，由3名试验人员做一次重复试验，并在四免后21 d采血收获，测定琼扩效价。

2 结果与分析

2.1 琼脂扩散试验 用琼脂扩散试验方法测定血清抗体效价，结果见表3。血清琼扩效价随时间呈递增趋势，且在四免后21 d效价可以达到1:16以上，可以收获全部血清。

表3 琼脂扩散试验方法测定抗体效价结果

2.2 物理性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验 从血清中随机抽取5支按《中国兽药典》方法进行物理性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验，物理性状均符合要求，均无菌生长，无支原体生长，且无外源病毒污染，检验合格。

2.3 猪常见病原检测 按表1方法进行检测，猪肺炎支原体（Mhp）抗体结果为阳性，其余结果均为阴性。所获血清与猪鼻支原体抗原的琼脂扩散试验结果无沉淀线产生，说明血清中无猪鼻支原体抗体。结果符合预期。

2.4 细菌内毒素测定 按《中国兽药典》方法进行细菌内毒素测定，每毫升血清的内毒素含量低于10 EU，符合规定。

2.5 鉴别检验 阳性血清中和组、培养基对照组均未变色，阴性血清中和对照组、病毒对照组培养基均变色，结果符合预期。

2.6 重复性试验 结果见表4。结果显示琼脂扩散试验效价均≥1:16，说明本试验具有可重复性。

表4 重复性试验效价测定结果

3 讨论

1）本研究以兔作为试验动物，相较于猪成本大大降低，同时规避了同源动物其它外源病毒的污染风险；相较于鼠则在免疫、采血等操作中的便捷性、降低死亡率、提高血清获取量等方面有着较大优势。

2）通过无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、细菌内毒素测定、猪常见病原的抗原抗体检测，保证了所获得阳性血清的纯净性和特异性。通过重复试验证明本研究可操作性强、重复性好。

3）本研究操作简便，成本较低，制备的阳性血清具有良好的特异性和抗体效价，能够满足对猪肺炎支原体的研究、诊断、鉴别等相关需求。