竹鼠体内马尔尼菲篮状菌的分离鉴定及小鼠致病力试验

熊 飙 李英姣 陈盘余 黎寿生 唐作顺

（1.广西农业职业技术学院 南宁市 530007；2.广西陆生野生动物救护研究与疫源疫病监测中心 南宁 530007）

马尔尼菲篮状菌（Talaromyces marneffei，TM）原名马尔尼菲青霉菌（Penicillium marneffei，PM）是篮状菌属中的一种温度依赖性双相真菌[1]。该菌为高致病性的条件性真菌病原，可在免疫力低下的人群中引起散发性深部真菌病---马尔尼菲篮状菌病[2]。1956年Capponi等首先从越南野生中华竹鼠的病变肝脏分离出马尔尼菲篮状菌[3]，1985年邓卓霖在国内报道从广西竹鼠体内分离出该菌[4]。2020年，为探讨竹鼠与人类马尔尼菲篮状菌感染的流行病学关系，笔者收集了广西壮族自治区11个地区的21只竹鼠进行真菌分离及小白鼠致病力试验。

1 材料与方法

1.1 动物来源 从广西壮族自治区11个地区分别收集21只竹鼠，其中南宁市5只、河池市4只、贵港市3只、防城港市2只、梧州市1只、桂林市1只、玉林市1只、来宾市1只、贺州市1只、崇左市1只、钦州市1只。21只竹鼠外观健康，采食正常。

1.2 试剂 沙堡弱琼脂培养基，由广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.3 方法 将竹鼠处死后用5%来苏尔浸泡10～20 min[5]，于无菌操作下解剖，观察竹鼠的体表、皮下组织、心、肝、脾、肺、肾、膀胱、胃、肠道、胰腺等组织与内脏器官，均未发现肉眼可见的病变。随机取肺门组织、肝、肾、脾、肠系膜淋巴结约米粒至黄豆大的组织碎片，接种于沙堡弱琼脂培养基上，分别置于25℃及37℃条件下培养。

2 结果与分析

2.1 竹鼠各种组织培养马尔尼菲篮状菌结果21只竹鼠中有20只内脏组织分离出马尔尼菲篮状菌，个体阳性率高达95.238%。竹鼠各组织器官分离出马尔尼菲篮状菌的阳性率分别为：肺85.714%，肝52.381%，肾14.286%，脾47.619%，肠系膜淋巴结52.381%。见表1。

表1 竹鼠各种组织马尔尼菲篮状菌分离培养结果

2.2 不同温度下菌落培养特征 在沙堡弱琼脂培养基上，25℃培养第3 d可见淡灰色膜样或淡黄白色绒样较小菌落，无色素产生，第7 d菌落较大并呈现淡黄间白色绒状或粉红色绒状，可见菌落周围培养基呈棕红色或玫瑰红色（见图1A），第15 d整个培养基均呈棕红色，菌落有脑回样皱褶，部分呈现白色绒状、粉红色绒状或淡褐色绒样；37℃培养于第5 d可见较小的乳白色或淡灰褐色膜样小菌落（见图1B），第10 d较成熟菌落颜色无变化，有脑回样皱褶，无色素产生，第15 d脑回样皱褶菌落增大，仍无色素产生。以上均符合马尔尼菲篮状菌在25℃与37℃下培养的菌落特征。

图1 沙堡弱培养基上培养的PM

2.3 显微镜下菌体形态 培养物用姬姆萨染液、瑞氏染液或过碘酸雪夫染液染色[6]。沙堡弱琼脂培养基25℃条件下培养，成熟菌落显微结构呈霉菌相，菌体有典型的帚状枝、双轮生；在37℃培养时显微结构呈酵母相，见混有少量短菌丝的椭圆形、圆形及长形且表面光滑的酵母样菌体。符合马尔尼菲篮状菌在25℃及37℃条件下培养的显微结构特征。

2.4 动物试验 以3号竹鼠肺、4号竹鼠脾、8号竹鼠肺、9号竹鼠肝分离出的马尔尼菲篮状菌用生理盐水将其调成1个麦氏单位的菌悬液，分别向Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号小白鼠腹腔注射0.1 mL菌悬液。注射后第7 d，4只小白鼠全部死亡。5%来苏尔浸泡死亡小白鼠10～20 min后，于无菌操作下解剖，见4只小鼠肝叶有针尖大白色脓肿，1只输尿管旁有直径约3 mm脓肿（见图2），1只肾脏旁见直径约2 mm脓肿（见图3）。

图2 输尿管旁脓肿

图3 肾脏旁脓肿

在沙堡弱琼脂培养基上接种小鼠肝、肾等相应病变组织，置于25℃及37℃分别培养15 d，均分离出与原接种菌一致的马尔尼菲篮状菌。试验小白鼠脓肿组织病理学检查[7]（苏木精-伊红染色和碘酸雪夫染色），可见巨噬细胞胞质内有淡蓝色颗粒（马尔尼菲篮状菌的核），染色结果判定为阳性。动物试验说明，竹鼠体内分离出的马尔尼菲篮状菌可致试验小白鼠发生多发性脓肿，具有致病性。

3 小结与讨论

本研究从广西11个地级市收集21只竹鼠，除南宁市横县1例幼龄竹鼠外，其余全部分离出马尔尼菲篮状菌，地区阳性率高达100%，个体阳性率为95.238%。可见广西地区竹鼠个体马尔尼菲篮状菌带菌率极高。20只体内携带马尔尼菲篮状菌的竹鼠，临床观察无异常，解剖脏器组织无肉眼可见病变，组织病理学检查反应极弱或无，结合前人对竹鼠马尔尼菲篮状菌健康带菌的报道，故马尔尼 菲篮状菌的自然宿主可能是竹鼠，其健康带菌，不 致病。

21只试验竹鼠中有18只的肺组织分离出马尔尼菲篮状菌，个体阳性率高达85.714%；11只的肝脏分离出马尔尼菲篮状菌，个体阳性率52.381%；3只的肾脏分离出马尔尼菲篮状菌，个体阳性率14.285%；10只的脾脏分离出马尔尼菲篮状菌，个体阳性率47.619%；11只的肠系膜淋巴结分离出马尔尼菲篮状菌，个体阳性率52.381%。结合在肺组织中该菌检出率最高，肝脏与肠系膜淋巴结其次，可见呼吸系统是马尔尼菲篮状菌进入竹鼠体内的主要途径，其次是消化系统。脾脏的高检出率，说明马尔尼菲篮状菌进入竹鼠体内后，网状内皮系统是主要受侵犯的脏器组织之一。