单增李斯特菌plcB缺失株的生物学特性及酵母双杂交诱饵载体构建

黄怡芳，吕洁婷，陈绵绵，程昌勇,宋厚辉

(浙江农林大学 动物科技学院/动物医学院 浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室，浙江 杭州 311300)

单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，简称单增李斯特菌)是一种人畜共患革兰阳性菌，该菌适应低温、低pH、高盐等应激环境并通过被污染的食物如肉类、海鲜、乳制品和蔬菜水果等传播给人类[1-3]。李斯特菌感染后可引起肠胃炎、败血症、脑膜炎及孕妇的流产，受感染患者的病死率高达30%[4-5]。因为单增李斯特菌的高致死率及全球范围内中毒性病例的频发，所以预防李斯特菌病对于公共卫生安全具有重大意义[6]。

作为一种胞内寄生菌，单增李斯特菌有多个关键毒力因子参与感染细胞的过程。首先通过菌体蛋白内化素A(InlA)和内化素B(InlB)与细胞表面的受体结合，实现菌体对宿主细胞的黏附、侵袭[7]。细菌进入细胞后被吞噬泡内化，在hly基因编码的李斯特菌溶血素O(LLO)和2种磷脂酶(PlcA和PlcB)的参与下，溶解吞噬泡的双层膜结构，从而逃逸进入细胞质开始复制和增殖[8-9]。其中，PlcB(由lmo0250编码)作为重要毒力蛋白之一，在单增李斯特菌感染、吞噬体逃逸、激发宿主机体免疫反应中发挥着至关重要的作用[10]。

单增李斯特菌在感染过程中能够通过操纵相关信号分子通路或调控宿主相关蛋白来逃逸机体的免疫应答[11-12]。基于此点，本研究通过同源重组的方式构建plcB基因缺失株及含plcB的酵母双杂交诱饵质粒，为筛选与毒力因子PlcB相互作用的宿主蛋白提供依据和工具，为进一步深入了解李斯特菌逃逸宿主天然免疫的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒及细胞来源本试验用到的菌株、质粒及细胞均为本实验室保存，主要包括：单增李斯特菌EGD-e、大肠杆菌DH5α、温度敏感性载体pKSV7、整合型穿梭载体pIMK2、小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)、小鼠成纤维细胞(L929)等。LB培养基用于大肠杆菌培养，BHI培养基用于李斯特菌培养，除特殊说明外，本试验菌株的培养条件均为37℃振荡培养。试验涉及引物见表1。

表1 试验所用引物

1.2 主要试剂酵母单缺添加剂(dropout supplement-Trp,SDO)、酵母显色底物(X-alpha-Gal,X-α-Gal)和金担子素A(aureobasidin A,Aba)均购于Clotech公司；0.003%的腺嘌呤硫酸盐酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPDA)、LB培养基和BHI培养基分别购于生工生物工程(上海)有限公司、Oxoid公司；胎牛血清(FBS)和杜尔培养基(DMEM)、KOD plus Neo PCR酶、限制性核酸内切酶、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PCR产物纯化回收试剂盒以及质粒提取试剂盒分别购自Thermo Fisher Scientific、Toyobo、NEB、碧云天公司、上海慧凌生物科技有限公司和天根生化科技有限公司。所用化学试剂均为国产分析纯。

1.3plcB缺失株构建

1.3.1ΔplcB重组缺失质粒构建 从NCBI数据库下载plcB基因序列(Gene ID：987036)及其上下游基因序列，通过Snapgene软件在plcB基因上下游各约500 bp处设计引物(ΔplcB-a/ΔplcB-b和ΔplcB-c/ΔplcB-d)，PCR扩增同源臂序列。利用重叠PCR方法将上下游同源臂连接获得用于同源重组的目的片段，将其克隆至pKSV7载体，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,测序成功后获得重组质粒pKSV7-PlcB。

1.3.2ΔplcB缺失株筛选和验证 将上述重组质粒pKSV7-PlcB电转入EGD-e感受态细胞中，通过温度和氯霉素抗性双重选择压力进行同源重组克隆筛选，利用引物(ΔplcB-a-front/ΔplcB-d)对筛选出的重组克隆进行PCR验证(缺失株应比野生株小870 bp 左右)，最终经测序验证所缺失的基因序列与预期设计相符后得到ΔplcB缺失株，并通过Western blot(WB)验证蛋白表达水平。

1.4 CΔplcB回补株构建通过Biocyc查询得知plcB与其他基因共用mpl启动子，通过Vector NTI软件在mpl上游启动子区及plcB完整基因下游设计引物(CΔplcB-/CΔplcB-b和CΔplcB-c/CΔplcB-d)并扩增序列，经双酶切连接等步骤将其克隆至单增李斯特菌整合型质粒pIMK2，获得重组质粒pIMK2-PlcB，测序鉴定后，将重组质粒用电击方法转入感受态ΔplcB缺失株，构建得到回补突变株，并通过WB验证表达水平。

1.5 胞内增殖试验用单增李斯特菌野生株EGD-e以及ΔplcB基因缺失株和回补株感染RAW264.7(MOI=1∶5)，30 min后用10 mmol/L PBS(pH7.4)洗涤3次，加入预冷的二馏水裂解细胞，将细菌倍比稀释至合适梯度，点板并放置37℃培养24 h 后进行细菌计数。细菌感染RAW264.7细胞1 h后，加入50 mg/L庆大霉素继续培养1 h以杀死胞外细菌，然后利用上述同样方法裂解细胞并进行细菌计数，此时记为2 h。加入5 mg/L庆大霉素后，分别于2,5,8 h收集细菌，点板计数，最后统计胞内细菌数并绘制折线图。

1.6 空斑试验用单增李斯特菌野生株EGD-e、ΔplcB基因缺失株及回补突变株感染L929细胞(MOI=1∶2.5)，1 h后用10 mmol/L PBS(pH7.4)洗涤3次，加入50 mg/L庆大霉素继续培养1 h以杀死胞外细菌，再用10 mmol/L PBS(pH7.4)洗涤3次后加入含终浓度为0.7% Agar、5 mg/L庆大霉素和含10%FBS的DMEM培养基3 mL，凝固后倒置培养2 d，用4%甲醛固定，弃去琼脂，用水洗净残余琼脂后，用5%结晶紫染色，观察结果并拍照记录。

1.7plcB酵母双杂交诱饵质粒构建通过Vector NTI软件在plcB基因(去除plcB信号肽)上设计引物(plcB-BD-F/plcB-BD-R),PCR扩增后将其克隆至pGBKT7-BD载体，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞,测序成功后获得重组质粒pGBKT7-BD-PlcB。

1.8 酵母双杂交诱饵质粒自激活及毒性试验

1.8.1自激活检测试验 将pGBKT7-BD-PlcB诱饵质粒转化到Y2HGold酵母菌株后，稀释100倍后涂布在SDO培养基，含pGBKT7-BD空载体的Y2HGold酵母菌株为阴性对照，培养3 d后观察并拍照。

1.8.2诱饵蛋白毒性试验 将pGBKT7-BD-PlcB诱饵质粒转化到Y2HGold酵母菌株后，调至相同D值，稀释到合适梯度点板，观察两者菌落量及菌落大小差异。

1.9 酵母双杂交诱饵质粒蛋白表达将pGBKT7-BD-PlcB诱饵质粒、pGBKT7-BD空载体、pGBKT7-53(阳性对照)、pGBKT7-lam(阴性对照)转化至酵母菌，在5 mL SDO液体培养基内30℃振荡过夜培养后，1∶100转接至YPDA培养基，30℃摇至D600=0.4～0.6，4℃离心后弃上清，用Cracking buffer裂解液裂解菌液后，超声破碎，离心后取上清用含β-巯基乙醇的Loading Buffer定量，用WB方法对样品进行分析。

2 结果

2.1 ΔplcB及CΔplcB重组菌的构建由图1可知，用引物(ΔplcB-a/ΔplcB-b)扩增获得plcB上游同源臂(图1A1)，用引物(ΔplcB-c/ΔplcB-d)扩增获得下游同源臂(图1A2)。重叠PCR得1 012 bp目的片段(图1A3)。电转后的pKSV7-PlcB菌落在42℃同源重组后，用引物(plcB-a-front/plcB-d)扩增菌落得到1 102 bp阳性片段(图1B1,2)，EGD-e为阳性对照(图1B3)。在30℃传代消除pKSV7质粒后，挑单菌落分别在含氯霉素抗性BHI液体培养基和琼脂平板上培养，2 d均不生长，证明pKSV7质粒已丢失。

根据CΔplcB重组质粒构建方法，用引物(CΔplcB-a/CΔplcB-b和CΔplcB-c/CΔplcB-d)扩增菌落获得上游同源臂(图1C1)和下游同源臂(图1C2)。通过重叠PCR获得1 012 bp目的片段。得到CΔplcB重组质粒目的片段1 243 bp(图1D1)。用引物(CΔplcB-a/CΔplcB-d)扩增电转入ΔplcB感受态的pIMK2-PlcB单菌落，得到阳性条带1 243 bp(图1E1～8)，以上均与预期条带相符。经测序及WB验证ΔplcB和CΔplcB蛋白表达水平(图1F)，ΔplcB无法表达蛋白，CΔplcB可表达蛋白，与预期设计相符，得到ΔplcB缺失株和CΔplcB回补株。

A.ΔplcB重组质粒构建(M.DL2000 DNA Marker，1.plcB上游同源臂，2.plcB下游同源臂，3.plcB目的片段)；B.ΔplcB缺失株验证(1,2.ΔplcB PCR筛选，3.EGD-e阳性对照)；C,D.CΔplcB重组质粒构建(1.mpl启动子，2.plcB全长，3.CΔplcB目的片段)；E.CΔplcB回补突变株验证(1～8.CΔplcB PCR 验证)；F.WB鉴定ΔplcB及CΔplcB突变株

2.2 体外生长曲线测定及细胞内增殖试验绘制EGD-e、ΔplcB和CΔplcB在37℃培养条件下的生长曲线，结果显示EGD-e、ΔplcB和CΔplcB的生长规律无明显差异，表明缺失plcB基因并不影响李斯特菌正常的生长速率(图2A)。EGD-e、ΔplcB和CΔplcB感染RAW264.7细胞后0.5,2.0 h，ΔplcB细菌感染量少于野生株及回补株；感染后5.0 h，ΔplcB数量相较与回补株差异显著(P<0.05)且与野生株相比差异极显著(P<0.01)，而回补株在巨噬细胞里的增殖能力得到部分恢复，表明缺失plcB基因减弱了细菌的胞内增殖能力(图2B)。

*示P<0.05；**示P<0.01；***示P<0.001。下同

2.3 李斯特菌空斑试验用EGD-e、ΔplcB及CΔplcB感染L929细胞(MOI=1∶2.5)，ΔplcB的空斑大小相较于野生株和回补株差异极显著(P<0.001)，且CΔplcB的空斑直径与野生株相比无显著差异(P<0.05)，缺失plcB基因后空斑形成能力减弱，表明ΔplcB降低了在细胞间的迁移能力(图3A，B)。

图3 EGD-e、ΔplcB和CΔplcB在L929细胞中迁移试验(A)及空斑直径分析(B)

2.4 酵母双杂交自激活、毒性试验及蛋白表达试验将诱饵质粒pGBKT7-BD-PlcB及空载体(阴性对照)转入酵母感受态细胞并涂布于各种缺陷培养基，结果显示，SDO均有白色菌落(图4A1，4)，SDO/X-α-Gal均不变蓝(图4A2，5)，SDO/X-α-Gal/Aba(图4A3，6)均不长菌，表明该质粒未在酵母中发生自激活。稀释菌落至合适梯度，在SDO固体培养基中点板验证，菌落数量及大小均无明显差异(图4B7，8)，表明该诱饵质粒在酵母中无毒性。

将含有诱饵质粒pGBKT7-BD-PlcB的酵母感受态细胞接种至5 mL SDO液体培养基中，30℃过夜培养，扩大培养后收集沉淀，用酵母裂解液裂解沉淀后，用Myc标签抗体对蛋白进行WB检测。结果表明转入诱导质粒pGBKT7-BD-PlcB的酵母能够表达PlcB蛋白，蛋白大小为51.3 kDa(图4C)。

图4 诱饵质粒的自激活(A)、毒性试验(B)、蛋白表达试验(C)

3 讨论

磷脂酶PlcB由289个氨基酸构成，结构域主要分为信号肽、前肽和成熟肽3部分。单增李斯特菌进入宿主细胞被吞噬泡内化后，菌体分泌磷脂酶PlcB后其信号肽将会被切除，在pH为酸性的吞噬泡中前肽被Mpl金属蛋白酶(mpl基因编码产物)切割加工从而激活，进而帮助菌体逃逸吞噬体，在细胞间增殖扩散[13-15]。研究表明，李斯特菌在Hep-2和HeLa细胞感染过程中缺失LLO后，PlcB的活性水平决定了吞噬泡的裂解效率；在Henle 407细胞中缺失LLO后，使PlcB高水平表达利于病原菌的胞间扩散感染[16-18]。

由于在李斯特菌感染及介导宿主诸多生物学机制中LLO的研究较为成熟，而另一种重要毒力因子磷脂酶PlcB的感染生物学功能研究报道较少[19-22]，本研究构建了PlcB缺失株及回补株，开展了该缺失株和回补株体外生存能力、在巨噬细胞RAW264.7中的增殖能力、在成纤维细胞L929间的迁移能力试验。结果进一步证实了磷脂酶PlcB在李斯特菌胞内感染和生存过程中发挥了重要作用，其功能主要是协助细菌逃逸吞噬体并进入细胞质增殖，本研究为进一步完善单增李斯特菌逃逸宿主的细胞天然免疫机制奠定基础。

酵母双杂交系统是将2种蛋白基因构建至酵母表达质粒中并通过两者相互作用激活下游转录因子来检测2个蛋白之间直接作用的工具[23-24]。酵母的转录激活因子可以分为2部分：DNA结合结构域(BD)和转录激活结构域(AD)，BD可以与启动子的上游激活序列(UAS)结合，AD则与RNA聚合酶结合来启动下游基因的转录，两者单独作用时无法激活转录因子，只有同时存在才能发挥激活效应[25-27]。在酵母双杂交系统中，诱饵蛋白与BD融合构建诱饵重组蛋白质粒，猎物蛋白与AD融合构建猎物重组蛋白质粒，将2种质粒同时转入酵母细胞中，AD与BD在空间上无限接近，若此时激活了下游报告基因的转录，表明2种蛋白能发生相互作用[28-30]。为探究磷脂酶PlcB在感染宿主细胞的过程中是否能与宿主蛋白相互作用从而影响菌体在细胞中增殖，本研究构建了诱饵质粒pGBKT7-BD-PlcB,该质粒对酵母Y2HGold细胞无毒性、无自激活反应且能稳定表达蛋白，因此重组诱饵质粒pGBKT7-BD-PlcB可用于酵母双杂交文库的筛选。本次试验为进一步筛选与磷脂酶PlcB发生相互作用的宿主蛋白奠定了基础。