HPLC 法测定五指毛桃中补骨脂素含量及质量评估

叶晓玲 赖吉俭 张锦炳

五指毛桃也称五爪毛桃,主要应用于肝炎、脾虚浮肿等疾病治疗［1］。有研究人员表明［2］,香豆素类是五指毛桃各成分中有效的成分之一,而补骨脂素便是一种呋喃香豆素类化合物,具有抗病毒、消炎等突出作用,在五指毛桃的各项组成成分中,补骨脂素是最为主要的一种有效成分［3］。此次研究获取来自不同地区的10 批五指毛桃作为研究样本,并采用HPLC 法进行提取,对波长进行设定,从而对五指毛桃进行鉴别和测定,为检查等方面提供有效的依据。现报告如下。

1 一般资料

1.1 试验药材 此次获取的补骨脂素是由中国药品生物品鉴定所生产及提供的,CAS 号为66-97-7,批号为110739- 201617；所使用的乙腈由上海麦克林生化科技有限公司提供,货号为A800361-5 ml,色谱纯级别,超纯水等,在其他研究过程中所用试剂为分析纯。此次研究获取的五指毛桃样本来自广西、广东、云南、福建以及贵州等地,共10 批药材样本,将其进行编号为1#～10#,并将获取的五指毛桃样本做烘干处理,然后将其粉碎,过40 目筛后留备用。

1.2 试验仪器 研究使用了由美国Waters 生产的高效液相色谱仪来进行试验检测,还使用了二极管阵列检测器以及岛津Shim-pack VP-ODS 色谱柱(规格为长250 mm,粒径为5 μm,内镜为4.6 mm),日本生产,产品货号为228-34937-91,使用了由广州瑞明仪器有限公司生产的高FA2104N 型电子分析天平,还使用了由北京天佑恒达科技有限公司生产的KQ5200 型超声波清洗器。

2 方法及结果

2.1 色谱柱条件 此次试验研究主要是将补骨脂素与获取的样本实施190～600 nm 的波长进行扫描,从而来对其最大吸收波长进行确定。

此次研究使用岛津Shim-pack VP-ODS 色谱柱(规格为长250 mm,粒径为5 μm,内镜为4.6 mm)；将乙腈-(35∶64)设定为流动相,洗脱方式为等度洗脱；将流速设定为1.0 ml/min；检测波长为246 nm,柱温为34℃。在此条件下将补骨脂素及其对照品保留10 min左右。

2.2 制备供试品溶液 取出五指毛桃经处理后的粉末适量,并以《中国药典》(2010 年版)［4］附录中ⅡC方法操作规定为依据,对五指毛桃粉末进行显微鉴别,同时以《中国药典》(2010 年版)附录中提及的ⅨH、ⅨK、ⅩC 方法为依据加以操作,分别对五指毛桃样本中包含的灰分、水分以及醇性浸出物进行测定。

2.3 制作补骨脂素对照品的标准曲线以及精密称量 将已完成制作的10.4 mg 补骨脂素置于10 ml 量瓶中,然后通过甲醇将其溶解,将容量确定为10 ml,然后使用精密测量仪器制备对照品溶液,溶液的浓度差分别为0.564、2.257、4.514、9.027、18.054、36.108、72.218、144.435 mg/L。然后从各种浓度的对照品溶液中吸取10 μl,使用色谱仪对其峰面积分别进行测量,将纵坐标设置成峰面积积分值,将横坐标设置成补骨脂素对照品的量,然后通过线性回归方式进行分析,通过分析得出结果为r=0.9997,线性范围是0.5～290.0 μg。然后再使用精密仪器将对照品溶液吸取,取量为10 μl,依据研究过程中设置的色谱条件,重复检测样品,检测次数为6 次,对所测峰面积进行记录,通过分析显示得出补骨脂素的峰面积RSD 值可达0.52%,这表明仪器的精密度较为良好,可对其进行使用。

2.4 稳定性评估 将同批次样本供试样溶液10 μl,通过精密仪器将其吸取,吸取量为10 μl,然后马上对样本补骨脂素的含量进行测定,并分别在2、4、12、24 h后通过同样的测定方法进行测量,通过测量结果显示,补骨脂素的锋面值RSD 可达到0.64%,此测定结果说明此样本在24 h 内的稳定性表现良好。

2.5 重复性检测 以随机的方式从10 份样本中抽取出同批次五指毛桃,取量应为1 g,并将其制备成供试样本,对每个样本之中的补骨脂素含量进行检测,通过检测结果显示RSD 可达1.82%,此结果说明这种方法具有良好的重复性。

2.6 加样回收试验 准备好浓度为210 mg/L 的1 ml补骨脂素,并将该材料加入到精密仪器之中,液体完成挥发之后,称取同批次含补骨脂素的五指毛桃,称取量为0.6 g,然后将其制备成供试样本,通过检测,其平均回收率均能够达到90%以上,其中,RSD 可达1.926%,通过加样回收试验研究结果表明,此次研究所采取的全部方法具有良好的回收效果,详细数据见表1。

表1 加样回收试验结果

2.7 检测样本含量 此次研究对各产地五指毛桃的粉末样本进行了测量,样本取量为1.0 g,通过HPLC 法对所选样本进行检测,通过检测结果表明,所有五指毛桃样本中补骨脂素的含量均在0.043%～0.069%之间,其中,广东河源地区的五指毛桃补骨脂素含量最高,为0.069%,见表2。色谱图见图1。

图1 补骨脂素对照品(A)与五指毛桃(B)高效液相色谱图

表2 各样本五指毛桃补骨脂素含量检测结果汇总

3 讨论

五指毛桃是桑科植物的一种,虽然其名字里面含有“桃”字,但其并不是桃,之所以称之为“五指毛桃”主要是因其叶子长得像五指,并且叶片上分布着较多的细毛,当其果实成熟的时候,果实外表与毛桃非常相像,从而称之为“五指毛桃”［5］。该植物具有较高的药用价值,是健脾补肺、行气利湿、舒筋活络的专用中草药［6］。有研究对五指毛桃的乙醇提取物的醋酸乙酯及氯仿进行了化学成分研究［7］,研究分离得到4 种化合物,之后又通过质谱法、核磁共振波谱法、薄层色谱法、紫外光谱法、红外光谱法以及高效液相色谱法等方法进行了结构鉴定,通过鉴定得出,五指毛桃所含4 种主要化合物分别为补骨脂素、β-谷甾醇、佛手柑内酯以及邻苯二甲酸二异丁酯［8］。

而从民族用药经验方面来看,五指毛桃被使用的疾病更加广泛,例如肺气肿、重症肌无力等方面的疾病,五指毛桃均可发挥一定的功效［9］。当前国家地方相关药物质量评价标准只是从TLC 鉴别一级性状等方面来对五指毛桃的质量进行评价和检测［10］,这种评测方式无法满足五指毛桃大面积规模化种植的临床需求。早于2004 年,我国发布了《广东省中药材标准》［11］,但作为盛产五指毛桃的大省,该标准中居然并未收录五指毛桃的相关含量检测项目,而从上述内容中可以了解到,其中包含的有效成分的极性比较小,通常采取极性较小的溶剂进行展开测定,通过甲苯-丙酮、正乙烷-醋酸乙酯、氯仿-正丁醇等一系列展开剂依据薄层色谱法来进行试验［7,12］,通过补骨脂素对照品以及对照药材来实施对照,即便是采取这些方法,五指毛桃的质量标准也未曾收录［13］。所以应该构建更为科学合理的五指毛桃质量标准,从而使《广东省中药材标准》得以完善,并且还能够为《中国药典》构建质量标准体系创造相应的参考条件。可见五指毛桃的药学价值是非常大的［14］。

在本次研究中,通过HPLC 法对五指毛桃进行提取过程中,对其样本采集、试剂提取、波长测量等实施了细致的研究,最后对HPLC 提取的具体流程进行了确定,最后选择了流动性乙腈-水完成分离,采用甲醇进行提取,超声波提取,通过此次研究结果显示,补骨脂素的提取方法具有较高的精密度,并且在稳定性方面也比较高,在可重复性方面比较强,这些研究结果充分证实了该研究方法的有效性,可以作为五指毛桃质量控制的相关参考依据。同时,此次研究还进行了加样回收试验,经试验研究得出,检测的平均回收率均可达到90%以上,平均回收率可达到99.56%,RSD 为1.926%,说明此次研究的方法具有良好的回收效果,最后,对样本含量进行了检测,主要检测了10 个样本补骨脂素含量,经检测得出,10 个样本中补骨脂素含量最高为0.069%,最低含量为0.043%。此外,此次研究结论弥补了以往研究中的不足,例如,上文所述研究并未对不同产地五指毛桃作为研究,仅对不同采收年份、不同类型品种以及不同采收季节三个方面得出研究结果,而本次研究则选择了我国10 个市对五指毛桃中补骨脂素的含量及质量标准进行研究,并得出广东河源的五指毛桃补骨脂素的含量最高,这也是该地区规模化种植五指毛桃的主要依据,对不同产地五指毛桃中补骨脂素含量的研究便是对当前研究不足的完善。

综上所述,经过程序优化后的HPLC 法对补骨脂素的提取更加简单快捷,可行性表现突出,并且能够保证结果的准确性和稳定性,能够对五指毛桃的质量评估提供有效依据,应予以推广。